线粒体呼吸链复合体Ⅳ/细胞色素C氧化酶测试盒 微量法

线粒体呼吸链复合体Ⅳ/细胞色素C氧化酶测试盒 微量法  正式测定务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
规格:100管/48样,100管/96样 ;  50管/24样,50管/48样
测定方法:可见分光光度法,微量法

需自备的仪器和用品
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制
试剂一:液体100mL×1瓶,-20℃保存;
试剂二:液体20mL×1瓶,-20℃保存;
试剂三:液体1.5mL×1瓶,-20℃保存;
试剂四:液体25mL×1瓶,-20℃保存;
试剂五:液体1mL×1支,-20℃保存;
试剂六:粉剂×1支,-20℃保存,用时加入2mL蒸馏水;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
工作液的配制:临用将试剂五转移到试剂四中混合溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

样本的处理:
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
① 准确称取0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
② 将匀浆600g,4℃离心5min。
③ 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。
④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅰ(此步可选做)。
⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体,加入200uL试剂二和2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10,重复30次),用于复合体Ⅰ酶活性测定。

测定步骤:
1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 样本测定

(1)工作液于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育5min。
(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、200μL工作液和15μL试剂六,混匀,记录340nm处初始吸光值A1和 2min后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。
复合体Ⅰ活力单位的计算
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

(1)按蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1808×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2) 按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=365×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.73×ΔA
V反总:反应体系总体积,2.25×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,2 min;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。
b.使用96孔板测定的计算公式如下:

(1)按蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=3616×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2) 按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
 复合体Ⅰ活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=730×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=1.46×ΔA
V反总:反应体系总体积,2.25×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,2 min;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。

本产品仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的,不可用于人类或动物的临床诊断或治疗,非药用,非食用。

原创作者:上海生物科技有限公司

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