乳酸脱氢酶（LDH）测试盒 微量法

乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒

乳酸脱氢酶（LDH）是一种氧化还原酶（EC1.1.1.27），广泛存在于各种生物体中。它催化丙酮酸和乳酸相互转化，同时伴随着 NADH和 NAD+的相互转化。在缺氧条件下，它将糖酵解的终产物丙酮酸转化为乳酸。LDH 定量是有临床意义的，因为某些 LDH 同工酶的血清水平反映了特定组织中的病理条件。当疾病、伤害或有毒物质损害组织时，细胞的乳酸脱氢酶释放到血液中。由于乳酸脱氢酶是一种相当稳定的酶，因此它已被广泛用于评估组织和细胞的损伤和毒性。CheKine™ 乳酸脱氢酶（LDH）活性检测试剂盒（微 量法）提供了一种简单、简便的微量法，用于测定动植物组织、细胞、血清（浆）和其他生物液中的乳酸脱氢酶。在此微量法中，LDH 将 NAD 还原为 NADH，NADH 与 WST-8 相互作用产生颜色，从而进行比色测定(λmax=450 nm）。

名称	规格（96T）	储存条件
Assay Buffer (5×)	25mL	4℃
Lactate	1.2mL	-20℃，避光保存
NAD	1mL	-20℃，避光保存
WST-8	600μL	-20℃，避光保存
Enhancer	120μL	-20℃，避光保存
Lactate Dehydrogenase Standard (100 U/mL)	0.5mL	-20℃，避光保存

 

动植物组织、细胞、血清（浆）等液体样本

1-20 U/mL

自备耗材：
酶标仪或可见分光光度计（能测 450 nm 处的吸光度）
恒温箱、制冰机、低温离心机
96 孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备：注意：各组分（小管试剂）开盖，请先低速离心。
1×Assay Buffer: 使用，Assay Buffer (5×)用去离子水稀释 5 倍，浓度为 1×Assay Buffer，平衡到室温；4℃保存。
Lactate: 即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；分装避光保存于-20℃。
NAD: 即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；分装避光保存于-20℃。
WST-8: 即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；分装避光保存于-20℃。
Enhancer: 即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；分装避光保存于-20℃。
Working Reagent：每孔准备 55 µL 工作液，现配现用：吸取 31 µL 1×Assay Buffer，8 µL NAD, 5 µL WST-8, 1 µL Enhancer 和10 μL Lactate 混合均匀。
Lactate Dehydrogenase Standard (20 U/mL)：把 200 µL Lactate Dehydrogenase Standard 用 800 μL 1×Assay Buffer 稀释至 20U/mL，混合均匀；冰上避光放置；分装保存于-20℃。
标准曲线设置：按下表所示，用 1×Assay Buffer 将 20 U/mL 标准品稀释为 20、16、12、8、4、2、1 U/mL 的标准溶液。

序号	20 U/mL Standard 体积（µL）	1×Assay Buffer 体积（µL）	标准品浓度（U/mL）
Std.1	200	0	20
Std.2	160	40	16
Std.3	120	80	12
Std.4	80	120	8
Std.5	40	160	4
Std.6	20	180	2
Std.7	10	190	1

样本制备：
注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。
1、动植物组织：称取约 0.1 g 样本，加入 1 mL 预冷的 1×Assay Buffer，冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心 15 min，取上清液，置冰上待测。
2、细胞：收集 500 万细胞到离心管内，用冷 PBS 清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL 1×Assay Buffer，冰浴超声波破碎细胞 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30 次），然后 10,000 g，4℃离心 15 min，取上清液，置冰上待测。
3、血清、血浆等液体样本：直接测定。
 

实验步骤：
1、酶标仪或可见分光光度计预热 30 min 以上，调节波长到 450 nm，可见分光光度计用去离子水调零。
2、操作表（下述操作在 96 孔板或微量玻璃比色皿中操作）：

试剂	空白孔（μL）	标准孔（μL）	测定孔（μL）
样本	0	0	50
Standards	0	50	0
去离子水	50	0	0
Working Reagent	50	50	50

3、混匀后，37℃避光孵育 30 min，测定 450 nm 处吸光度，空白孔记为 A _空，标准孔记为 A _标，测定孔记为 A _测。计算ΔA _测=A _测-A _空，ΔA _标=A _标-A _空。

注意：实验之建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA 测小于 0.001 可适当加大样本量。如果ΔA _测大于 2.0，样本可用 1×Assay Buffer 进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算：
注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为终计算公式。
1、标准曲线的绘制
以标准溶液浓度为 y 轴，ΔA _标为 x 轴，绘制标准曲线。
2、LDH 含量的计算
将样本的ΔA _测代入方程得到 y 值（U/mL）。
(1) 按样本鲜重计算
LDH 含量 (U/g 鲜重)=y×V _样÷(W×V _样÷V _样总)×n=y÷W×n
(2) 按蛋白浓度计算
LDH 含量 (U/mg 蛋白)=y×V _样÷(V _样×Cpr)×n=y÷Cpr×n
(3) 按样本体积计算
LDH 含量 (U/mL)=y×V _样÷V _样×n=y×n
(4) 按细胞数量计算
LDH 含量 (U/10 4 cells)=y×V _样÷(500×V _样÷V _样总)×n=y÷500×n
V _样：加入样本体积，0.05 mL；W：样本质量，g；V _样总：加入 1×Assay Buffer 体积，1 mL；n：样本稀释倍数；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；500：细胞总数，500 万。

 

乳酸脱氢酶是一种存在于多种生物体中的氧化还原酶。它催化丙酮酸盐和乳酸盐的相互转化，伴随着NADH和NAD+的相互转化。它在缺氧条件下将糖酵解的终产物丙酮酸转化为乳酸。乳酸脱氢酶定量具有临床意义，因为某些乳酸脱氢酶同工酶的血清水平反映了特定组织的病理状况。当疾病、损伤或有毒物质损坏组织时，细胞乳酸脱氢酶释放到血流中。由于乳酸脱氢酶是一种相当稳定的酶，乳酸脱氢酶被广泛用于评估组织和细胞的损伤和毒性。

-20℃，避光保存，有效期 6 个月。

1、开盖，先离心。
2、进行预实验，确保读数在标准值范围内。
3、使用新鲜的样本。如果不立即分析，样本可在-80°C储存一个月。