豚鼠钙调素(CAM)ELISA试剂盒说明书

注意事项 操作洗板方法：
1.手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。
2.自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
说明
1.在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染，试剂避免受到微生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。
2.浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
3.刚开启的酶标板孔中可能会有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。
4.所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。
5.有效期：6个月。
6.本操作说明适用于48T试剂盒，但48T试剂盒所有试剂减半。
7.电子版说明书仅供参考，实际操作请按照随产品发送的印刷版说明书；中英文说明书可能会有不一致的地方，以英文说明书为准。

操作流程：
（1）待测样品孔中每孔加入待测样品100μl，每种样品设3个平行孔；设两个阴性对照孔，每孔加未处理组的细胞裂解液100μl；另设一个空白对照孔，加入纯细胞裂解液100μl。
（2）酶标板置4℃，包被过夜。
（3）洗板：吸干孔内反应液，用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去），之后将洗涤液注满板孔，浸泡1-2分钟，间歇摇动。甩去孔内液体后在吸水纸上拍干。重复洗涤3-4次。
（4）阴性对照孔每孔加入PBS 50μl，样品孔及空白孔每孔加入1:500稀释的兔抗人AIF抗体工作液50μl。
（5）酶标板置37℃培养箱的湿盒内，孵育60min。
（6）洗板，同（4）。
（7）每孔加1:5000稀释的HRP-标记的山羊抗兔抗体工作液 100μl。
（8）酶标板置37℃培养箱的湿盒内，孵育60min。
（9）洗板，同（4）。
（10）每孔加TMB显色液 100μl，轻轻混匀10s，置37℃暗处反应15-20min。
（11）每孔加100μl 2mol/L H2SO4终止反应。
（12）分别测450nm 吸光值W1和630nm吸光值W2，*终测得的OD值为两者之差（W1-W2），以减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。
（13）数据处理：在得出标本（S）和阴性对照（N）的 OD值后，计算S/N值。S/N≥2.1为阳性判定标准。

操作步骤：
（1）双抗体夹心法是检测抗原zui常用的方法。夹心法利用两种一抗对目标抗原进行捕获和固定，在确保灵敏度的同时大大提高了反应的特异性，该方法的检测灵敏度可提高到pg级的水平。将已知抗体包被到固相表面，加入待检标本，标本中若含有相应抗原即与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合成分，加入该抗原特异的酶标记抗体，洗去未结合的酶标记抗体，加底物后显色。若标本中无相应抗原，固相表面即无抗原结合，加入的酶标记抗体则不能结合于固相并被洗涤去除，当加入无色底物后，因无酶催化故不显色。双抗体夹心法适用于测定2价或2价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。
（2）间接法是检测抗体zui常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。先将待测的蛋白包被在孔板内，然后依次加入一抗、酶标记u akn 的二抗和底物显色，通过仪器（例如酶标仪）定量检测抗原。这种方法操作简单但由于高背景而特异性较差，目前已逐渐被夹心法取代。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标二抗建立检测相应抗体的方法。间接法成功的关键在于抗原的纯度。间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体。
（3）竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被于固相。如抗原中有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质，然后再加入标本和酶标抗体进行竞争结合反应。小分子抗原或半抗原因缺乏可用于夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，zui后的显色也愈浅。

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