为了研究RNA的功能,通常通过逆转录(RT)将RNA转化为更稳定的互补DNA(cDNA)。cDNA可通过克隆、PCR和测序等技术研究RNA,因此,逆转录是许多RNA实验工作流程的关键步骤。
逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)
在RT-PCR中,通过逆转录(RT)将RNA转化为cDNA,然后通过聚合酶链式反应(PCR)扩增cDNA(图1)。利用cDNA扩增步骤,有望对初始RNA进行进一步研究,即便RNA样本数量有限或低丰度表达。RT-PCR的常见应用包括表达基因检测、转录物变异检测,以及克隆和测序用cDNA模板制备。
Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)
图1. 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。RT =逆转录,RTase =逆转录酶
由于逆转录可为PCR扩增和下游实验提供cDNA模板,因此,它是实验成功的关键步骤之一。选定的逆转录酶应对所有样本均具有最高效率,即便是难转录RNA样本,如降解、抑制剂残留或具有高度二级结构的RNA样本。
一步法和两步法是两种最常用的RT-PCR方法,每种方法都具有各自的优缺点(图2)。
顾名思义,一步法RT-PCR在单个反应管中将第一链cDNA合成(RT)和后续PCR反应结合在一起。该反应设置可简化工作流程、减少结果差异,并将污染的可能性降至最低。一步法RT-PCR简化了大量样本的处理,适用于高通量应用。但是,一步法RT-PCR采用基因特异性引物进行扩增,将分析局限于每个RNA样本中的几个基因。由于反应需兼顾逆转录和扩增条件,因此,一步法RT-PCR在某些情况下可能具有较低的灵敏度和效率。但是,在RT-PCR中使用基因特异性引物,有助于最大化目标cDNA的得率,并最小化扩增背景。
One-step vs. two-step RT-PCR
图2. 一步法和两步法RT-PCR的比较。
两步法RT-PCR包含两个独立反应,首先进行第一链cDNA合成(RT),然后在单个反应管中通过PCR扩增第一步骤中所得cDNA。因此,两步法RT-PCR可用于检测单个RNA样本中的多个基因。RT和PCR反应独立进行,可对每个步骤的反应条件进行优化,使逆转录引物选择(oligo(dT)引物、随机六聚体或基因特异性引物)和PCR反应建立(如DNA聚合酶选择和PCR组分)更灵活。与一步法RT-PCR相比,两步法RT-PCR的缺点包括多个步骤延长了工作流程、增加样本处理和操作步骤以及提高污染和结果变异的可能性。
表1. 对比一步法和两步法RT-PCR
两步法RT-PCR
反应建立 单独优化的逆转录和PCR反应
引 物 oligo(dT)、随机六聚体或基因特异性引物
最佳用途 分析多种基因
优 势 灵活
一步法RT-PCR
反应建立 在同时支持逆转录和PCR的条件下,将两个反应结合在一起
引物 基因特异性引物
最佳用途 分析一种或两种基因;高通量平台
优势 方便,高通量