DNase I-XT(耐盐)
#M0570L 5,000 units
#M0570S 1,000 units
产品特性
·耐盐型 DNA 特异性核酸内切酶
·用于降解双链和单链 DNA
·产生具有 5′-磷酸和 3′-羟基末端的短链寡核苷酸
·不含 RNase
DNase I-XT(耐盐)特别适用于:
·降解体外转录反应中的 DNA 模板
·去除 RNA 样品中残留的基因组 DNA
产品描述
DNase I-XT(耐盐)是基于 DNase I 改造的耐盐型 DNA 核酸内切酶,可非特异切割 DNA,产生具有 5′-磷酸和 3′-羟基末端的二核苷酸、三核苷酸和寡核苷酸产物 (1,2)。DNase I-XT(耐盐)作用于单/双链 DNA、染色体,以及 RNA:DNA 杂交链上的 DNA。当盐浓度>50 mM 时,不耐盐型 DNase I(无 RNase)(NEB #M0303)的活性会受到抑制,但 DNase I-XT(耐盐)(NEB #M0570)在 50-100 mM 盐浓度范围活性最佳,盐浓度达到 200 mM 时,可维持 65% 活性,300 mM 时,仍有~40% 活性。
图 1:DNase I-XT(耐盐)在盐浓度> 100 mM,能高效降解 DNA
在等摩尔的 DNase I (NEB #M0303) 和 DNase I-XT(耐盐)(NEB #M0570) DNase 活性比较中,DNase I-XT(耐盐)展示出更高的耐盐特性。检测方法为:在 1X DNase I 反应缓冲液中,消化标记有荧光和淬灭基团的发夹 dsDNA 底物(35 nt),荧光强度反映出不同盐浓度条件下的酶活(如图所示)。结果显示:DNase I 活性随着盐浓度的增加而下降,而耐盐的 DNase I-XT 在高达 300 mM 盐浓度中仍保持活性。
图 2:DNase I-XT(耐盐)能够更完全的去除 IVT 反应和 RNA 中的 DNA
20 μl 体外转录产物用以下三种方法检测去除残留 DNA 的效果:1) 无 DNase I;2) 2 U TURBO® DNase 或 3) 2 U DNase I-XT(耐盐),37°C 条件下孵育 15 分钟。分别使用 Monarch RNA 纯化试剂盒(500 µg)(NEB #T2050)纯化,以无核酸酶水(50 µl)洗脱。使用 Luna 通用探针法 qPCR 预混液(NEB #M3004)通过 qPCR 检测 DNA 残留水平。将每个样品的平均 Cq 值与标准曲线(灰色)进行比较,以评估可 PCR-扩增 DNA 的百分比。TURBO DNase 和 DNase I-XT(耐盐)的使用都不需要对 IVT 反应产物进行稀释,但是,DNase I-XT(耐盐)对 IVT 反应中的 DNA 模板去除更彻底,难以通过 qPCR 检测到。
图 3:DNase I-XT(耐盐)有效去除 RNA 粗提产物中的残留 DNA
RNA 粗提样本用以下四种方法检测去除残留 DNA 的效果:1) 无 DNase I;2) 在 DNase I-XT 反应缓冲液中加入 DNase I-XT(耐盐)(2 U, NEB #M0570);3) 在 DNase I 反应缓冲液中加入 DNase I (2 U, NEB #M0303);4) 在 TURBO DNase 反应缓冲液中加入 TURBO DNase (2 U, ThermoFisher) ,37°C 条件下孵育 15 分钟。使用 Luna 通用一步法 RT-qPCR 试剂盒 (NEB #E3005) 和人类或小鼠 Actin 外显子引物,通过(+/- RT)qPCR 检测对残留的基因组 DNA (gDNA) 进行定量。以 qPCR(无反转录,仅扩增DNA)与 RT-qPCR(有反转录,同时扩增 DNA 和 RNA)平均 Cq 值的差值评估 DNase 去除 DNA 的效果。结果显示:对于 RNA 粗提产物中的残留 gDNA,DNase I-XT(耐盐)比 TURBO DNase 去除效果更彻底。