Faustovirus 病毒加帽酶(FCE)
#M2081L 2500 units
#M2081S 500 units
产品特性
·Faustovirus 病毒加帽酶(FCE)用于在 RNA 5′末端的三磷酸和二磷酸位置加 m7G-帽(Cap-0)
产品描述
Faustovirus 病毒加帽酶(FCE)在转录产物 5′末端的三磷酸和二磷酸位置催化加入 N7–甲基鸟苷帽(m7G),产生带有 Cap-0 帽的 RNA。FCE 是一种单亚基酶,具有给 RNA 加 Cap-0 帽所需的三种酶活:三磷酸酶,鸟嘌呤转移酶,(鸟嘌呤-N7)–甲基转移酶。真核生物 mRNA 成熟的关键步骤是:添加 Cap-0 帽结构、第一个核苷酸 2′-O-甲基化(Cap-1)和多聚腺苷化加尾(poly(A))。Cap-0 结构还增加了 RNA 的稳定性,避免三磷酸化的 RNA 激活天然免疫反应。
FCE 从低温至 55℃ 高温范围内,均能够维持加帽活性。一般情况下,1 µl FCE(25 units)可以在 37°C 条件 1 小时内完成>100 µg RNA 的加帽。本产品提供加帽所需的 GTP 和 S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。
来源:由大肠杆菌(E. coli)质粒表达 Faustovirus 病毒加帽酶(FCE)编码序列,C-端带有 His-tag。
图 1:FCE 提高加帽效率,优化操作流程
A. 分别使用 FCE 和牛痘病毒加帽系统(VCE)在 37℃ 条件下加帽。以含有不同 5´-UTR 序列(如图所示)的 FLuc 转录本(1.77 kb)作为加帽底物(200 μg,相当于约 350 pmol,浓度为 7 μM),分别使用 FCE(25 units 相当于 1 pmol,在 50 μl 体系中浓度为 20 nM)或 VCE(25 units 相当于 1 pmol,在 50 μl 体系中浓度为 20 nM)37℃ 孵育 1 小时。需要注意的是,上述条件低于我们推荐的酶用量,用以展示 FCE 比 VCE 的加帽效率更高,以及在流程优化上的优势。
B. 使用 FCE 分别在 37℃ 和 42℃ 条件下进行 mRNA 加帽。以含有不同 5´-UTR 序列(如图所示)的 FLuc 转录本(1.77 kb)作为加帽底物(200 μg,相当于约 350 pmol,浓度为 7 μM),使用 FCE(25 units 相当于 1 pmol,浓度为 20 nM)37℃ 孵育 1 小时。需要注意的是,上述条件低于我们推荐的酶用量,用以展示 FCE 在流程优化上的优势。加帽反应体系为 50 μl,含有 0.1 mM SAM、0.5 mM GTP、以及用于 FCE 反应的 1X FCE 加帽缓冲液或用于 VCE 反应的 1X 加帽缓冲液。反应结束后,进行靶向 RNase H 切割,并使用 LC-MS 检测 mRNA 加帽效率。
图 2:FCE 的 RNA 加帽反应适用于更宽泛的温度范围
分别使用 FCE 和 VCE 在 15℃-60℃ 条件下进行 RNA 加帽。20 μl 加帽反应体系中含有:2.5 μM RNA 底物(5´-三磷酸 20mer 3´-FAM)、8 nM 加帽酶、0.1 mM SAM 和 0.5 mM GTP。FCE 加帽反应在 1X FCE 加帽缓冲液中进行,VCE 加帽反应在 1X 加帽缓冲液中进行。所有反应在指定的反应温度下孵育 30 分钟。通过毛细管电泳检测反应产物。
图 3:FCE 可对各种 RNA 进行高效 5’加帽(50 units至少加帽 100 ug RNA)
上图展示了 FCE 对多种 mRNA 的加帽效果。以含有不同 5´-UTR 序列(如图所示)的 FLuc 转录本(共 1.77 kb)作为加帽底物(200 μg,相当于约 350 pmol,浓度为 3.5 uM),在含有 1X FCE 缓冲液的 100 μl 反应体系中加入 2 μl 的 FCE(50 units 相当于 2 pmol,浓度为 20 nM),37℃ 条件下孵育 1 小时。反应结束后,进行靶向 RNase H 切割,并使用 LC-MS 检测 mRNA 加帽效率。