产品资料 – 基因编辑 – 应用于CRISPR工作流程中的NEB特色产品
EnGen® 突变检测试剂盒
特性
· 基于 T7 核酸内切酶的基因编辑检测
概述
EnGen 基因编辑突变检测试剂盒为检测基因编辑效率提供一整套的试剂。试剂盒操作的第一步，首先使用
Q5 热启动超保真聚合酶 2× 预混液从待测细胞中扩增出目的基因组的靶标区域（即通过 CRISPR/Cas9、
TALENs或 ZFN等方法进行了基因编辑的区域)，经退火、延伸步骤后，形成异源双链 DNA。在扩增子池中经过多轮循环后，基因插入和缺失(Indels)等造成的突变得到富集。第二步，将退火后的 PCR 产物用 EnGen T7 核酸内切酶 I 进行切割。 EnGen T7 核酸内切酶 I 是一种结构特异性酶，可有效识别大于1个碱基的基因错配。当错配出现时，DNA 分子的两条链被切割从而形成较小的片段。分析片段图谱可以对基因编辑实验的效率进行评估。
EnGen 基因编辑突变检测试剂盒包含一组对照模板和引物预混液，可用作 PCR 反应及 T7 核酸内切酶 I 消化实验的对照。对照模板和引物预混液中含有 2 种对照质粒和 1 对对照引物。经 PCR 扩增、变性、退火后，部分会形成含有10个碱基的插入突变，此种异源双链 DNA 正是 T7 核酸内切酶 I 的底物，600 bp 的 DNA 会被切割成 200 bp 和 400 bp 的两个片段；而同源双链 DNA 则不被 T7 核酸内切酶 I 切割。通过琼脂糖凝胶电泳或片段分析设备可以非常方便的分辨出同源（野生型）和异源（突变）片段。
试剂盒的实验流程经过优化，通过 Q5 热启动超保真聚合酶 2× 预混液扩增得到的 PCR 产物可以不经纯化而直接用 T7 核酸内切酶 I 进行消化。 异源双链DNA 分子只需 15 分钟就可以被完全切割，随后用蛋白酶 K 将反应终止。 此外， Q5 热启动超保真聚合酶 2× 预混液还可以用于优化靶点扩增的实验 。
图1： 实验流程
将引物设计在已完成基因编辑位点的两侧，PCR 产物变性、退火后会生成三种结构。其中一种结构能够被 T7 核酸内切酶 I 切割（多于1个碱基错配的双链 DNA），经电泳分离和片段分析后，估算出基因编辑效率。
Engen 突变检测试剂盒组分
– Q5 热启动超保真聚合酶 2X 预混液
– NEBuffer 2
– EnGen T7 核酸内切酶 I
– 对照模板和引物预混液
– 蛋白酶 K.，分子生物级
– Quick-Load® 紫色 2-Log DNA Ladder （0.1 – 10.0 kb）
– 紫色凝胶上样染料 6X，无 SDS
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