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产品资料 – 基因编辑 – 应用于CRISPR工作流程中的NEB特色产品

EnGen® sgRNA 合成试剂盒,S. pyogenes

#E3322V10 rxns

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特性:

一个小时甚至更短时间内快速合成微克级的 sgRNA
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概述

EnGen sgRNA 合成试剂盒, S. pyogenes 能简单快速合成 sgRNA 。利用试剂盒提供的试剂和使用者自己设计的特异性 DNA 序列,单管反应 30 分钟就能获得大量 sgRNA 。
自然界中,S. pyogenes Cas9 的启动 2 种 RNA 有关。及 crRNA 和 trRNA。crRNA 又CRISPR RNA包含大约 20 个核苷酸,位于PAM (Protospacer Adjacent Motif)  NGG 序列的上游,与目标 DNA 反义链同源互补。另一种 tracrRNA  又称  transactivating crRNA tracrRNA 序列的一部分与 crRNA 互补,所形成的互补序列及二级结构可被 Cas9 识别。在实际操作中,将 tracrRNA  和 crRNA 的序列进行整合,形成一条长片段单链指导 RNA ( sgRNA)  , 并与 Cas 9 形成复合体,识别并切割目标 DNA。
在 EnGen 2X sgRNA 反应混合液中,含有能被 S. pyogenes Cas 9 识别并起支架作用的特异性序列,该序列的一部分能与使用者设计的目标特异序列部分重叠。退火形成互补链后由 DNA  聚合酶进行填充。最终生成用于转录的 dsDNA 模板。本试剂盒可在一个反应中完成 dsDNA 的合成及 RNA 转录,生成具有功能的 sgRNA。

实验流程:

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A.特异目标链包含三个部分,分别是 T7 启动子、~20 nt 目标特异性序列及与 S. pyogenes Cas9 识别支架序列互补的 14 nt 重叠区域(反应混合液中提供)。室温下,混合特异性目标链(或 EnGen sgRNA 调控序列)与 EnGen2X sgRNA 反应预混液(NTPs,dNTPs,S. pyogenes Cas9 识别支架序列)及 EnGen sgRNA 酶预混液(DNA 和 RNA 聚合酶)。B.在 37℃ 条件下,具有 14 nt 互补重叠区域的 2 个片段发生退火。C. DNA 聚合酶从 3´ 端开始延伸,形成一个双链 DNA 模板。D. RNA 聚合酶识别 T7 启动子及其下游的 dsDNA 并开始转录。最终形成的 sgRNA 包含目标特异片段、crRNA 和 tracrRNA。37℃ 条件下,单管反应 30 分钟即可完成所有步骤。

EnGen sgRNA 合成试剂盒,S. pyogenes 组分

– EnGen sgRNA 酶混合液
– EnGen 2X sgRNA 反应混合液,S. pyogenes
– DNase I (RNase-free)
– EnGen sgRNA control Oligo,S. pyogenes

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