BCFL AM (Superior replacement for BCECF AM)
pH荧光探针
BCFL AM; BCECF, AM;Dual-excitation ratiometric pH indicator 双激发光比率型pH荧光探针;SBFI AM ( Na+ Indicator);Fluo-8, AM;
产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 | |
BCFL AM (Superior replacement for BCECF AM) | MX4552-1MG | 1mg |
产品描述
BCFL AM是一种细胞膜渗透性的荧光探针,用来测定相对的胞内pH变化。是常用的比率型pH探针-BCECF(2′,7′-Bis-(2-Carboxyethyl)-5-(and-6)- Carboxyfluorescein)的优越替代物。与BCECF不同(至少由三种异构体构成的一种复合物,不同异构体之间的比率因批次而异),BCFL是单一异构体,具有更好的的结果重复性。BCFL具有与BCECF相同的光谱反应(单波长测定λex/λem=490/535nm;或比率测定λex/λem=505/ 535nm和λex/λem=430/535nm)(光谱特征见附录I)。BCFL AM表现出pH依赖的双激发性,pKa~7.0,以及一个激发交点(454nm)。BCFL AM的比率型成像使得胞内pH测定基本不受几种可变因素的影响,包括染料浓度、光径、细胞泄露和光漂白率。
产品特性
1) 同义名:BCFL AM ester; BCFL Acetoxymethyl Ester;
2) 分子量:~600
3) 溶解性:溶于DMSO
4) Ex/Em:503/528nm
注意事项
1)荧光染料都存在淬灭问题,操作或保存过程中尽量避光,减缓荧光淬灭。
2)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用方法
A、试剂准备
1. 10% Pluronic F-127母液配制【可选】
a)将1g Pluronic F-127(货号:MS4301-1G)溶于10ml去离子水,配制成10%(w/v)母液。
b)溶解过程中于40~50℃内加热10% Pluronic F-127母液30min,使其完全溶解。
c)10% Pluronic F-127母液室温保存,高达6个月稳定,不要冻存。
2. HHBS Buffer(货号:MS3510-500ML)或其他生理缓冲液
3. 丙磺舒(货号:MZ8471-1G)或水溶性丙磺舒(货号:MZ8472-154MG)【可选】
B、操作步骤
【注意】:以下实验步骤中用到非离子表面活性剂Pluronic F-127和有机阴离子转运抑制剂丙磺舒(Probenecid),这两种试剂虽然都是非必需的,但强力推荐使用。
1. 制备BCFL AM母液:于实验前,将低温保存的BCFL AM粉末(Mw:~600)置于室温回温至少20min。低速离心后加入高质量无水DMSO配制成10~20mM母液。比如:1mg BCFL AM粉末加入166μl DMSO充分溶解,混匀后即得到10mM母液。多余的母液根据单次用量分装,避光冻存,约3个月稳定
2. 用HHBS或其他的生理缓冲液制备2×工作液(含10μM BCFL AM和0.08% Pluronic F-127),比如,在合适的管子内混合6.4μl BCFL AM(10mM 储存液)和51.2μl 10% Pluronic F-127。之后,添加HHBS或其他生理缓冲液直到总体积为6.4ml。
【注意】:对于大部分的细胞系,建议BCFL AM的工作浓度为4~5μM。Pluronic F-127的终浓度建议为0.02~0.04%。
3. 吸取100μl 2×工作液到含100μl 细胞培养基的培养孔内,混匀,使得BCFL AM的终浓度为5μM和Pluronic F-127的终浓度为0.04%。
4. 置于37℃孵育30~60min。之后置于室温孵育30min。
5. 吸走200μl染色液,之后重新加入含1mM丙磺舒的HHBS Buffer或其他生理缓冲液。
6. 添加化合物到检测孔内。之后通过荧光检测来进行pH分析。【单波长检测:Ex/Em=490/535nm(cutoff=515nm);或比率测定Ex/Em=505/535nm和430/535nm(cutoff=515nm)】
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附录 BCFL探针pH依赖性的光谱特征。A)吸收光谱;B)发射光谱;C)激发光谱;图A)表明BCFL在pH4.5-9.0范围内的吸收光谱往红光迁移(450nm→505nm),且摩尔吸光系数增加到约90,000 cm-1M-1,反映了BCFL具pH敏感性的吸收特征。图B)表明BCFL在生理pH6–8范围内的发射光谱。与BCECF相似,BCFL在生理范围内的发射波长为526nm。图C)说明BCFL作为双激发比率型pH指示剂,具有激发等消光点(430nm)。
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