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Mag-Fura-2 AM, Cell Permeant 镁离子荧光探针

Mag-Fura-2 AM是一种胞内镁离子指示剂，属于紫外激发的比率型探针，与镁离子结合的Kd值为1.9mM。与Fura-2类似，Mag-Fura-2的激发波长历经蓝色迁移从369nm到330nm。Mag-Fura-2 AM具细胞膜渗透性，只需简单孵育，即可加载进入细胞。

产品特性

1） CAS NO.：130100-20-8

2） 化学名：5-Oxazolecarboxylic acid, 2-[5-[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethoxy]-6-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy] -2-oxoethyl]amino]-2-benzofuranyl]-(acetyloxy)methyl ester

3） 同义名：Furaptra, AM ester

4） 分子式：C₃₀H₃₀N₂O₁₉

5） 分子量：722.56 g/mol

6） 外观：黄色固体

7） 纯度：≥90%

8） Ex/Em：336/503 nm

9） 溶解性：溶于DMSO

10） 化学结构式：

保存与运输方法

保存：-20ºC干燥避光保存，至少一年有效。

运输：冰袋运输。

注意事项

1） 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

1. 储存液制备

取一管低温保存的Mag-Fura-2 AM,，置于室温回温至少20min。之后加入高质量无水DMSO配制成1~5mM储存液，比如50μg Mag-Fura-2 AM（Mw：722.56 g/mol）溶于13.8μl DMSO，充分溶解后，即得到5mM储存液。【注意】未使用的储存液分装储存在-20℃，避免反复冻融，且要避光保存。尽快使用完。

2. 操作步骤

【注意】以下使用方法仅作参考，需根据具体的细胞类型和实验要求做出调整。加载温度范围是RT~37℃，更高温度会提高加载速度，但更低温度能小化染料的内在化现象。表面活性剂Pluronic^® F-127有时加入能促进AM探针在水溶性缓冲液内的均匀分散。

2.1 在所需温度（25℃~37℃）预孵育细胞10min，使其离子梯度达到稳定和平衡。

2.2 取4μl Mag-Fura-2 AM储存液和5μl 20% Pluronic^® F-127，加入1ml细胞培养液，剧烈漩涡混匀得到均匀的探针分散液。

2.3 取250μl上述制备的探针分散液加入750μl含细胞的培养基内，混匀，此时得到终浓度为1~5μM的工作液，根据起始母液浓度来确定。

2.4 根据需求探针孵育15~60min。

2.5 细胞清洗3次，之后继续孵育30min以保证细胞内的探针完全去酯化。之后选择合适的仪器，进行荧光测定。

3. 响应校正

镁离子指示剂的校正方法基本与钙离子指示剂类似。需注意校正是在所有指示剂都已去酯化且都与离子结合的假设上进行。校正包括完全不含离子和离子完全饱和相对于外部控制镁离子浓度的荧光测定。胞内校正可能以两种方式进行，要么通过去污剂裂解细胞（通常使用地膏辛）将胞内指示剂释放进入周围溶液，要么通过一种离子载体来控制胞内镁离子，不用释放指示剂到周围溶液。比率型指示剂比如Mag-Fura-2也可能在无细胞溶液内进行校正，虽然偏好选择原位校正，由于指示剂对镁离子的亲和性依赖于胞浆环境。相对于离子霉素（MZ2151-1MG），镁离子校正时倾向选择离子载体A-23187（MZ2153-1MG）和4-bromo-A23187（MZ2154-1MG），由于前者能更有效的转运镁离子。用来校正镁离子指示剂的溶液初需不含重金属离子比如镁，否则会与镁离子指示剂结合。可通过二价阳离子螯合剂TPEN（MX4529-25MG）处理溶液。

3.1 对于具离子依赖性的光谱迁移的指示剂，比如Mag-Fura-2，K_d值（或Mg²⁺浓度，当Kd值已知）能通过以下公式进行换算：

R：代表荧光比值（F_λ1/F_λ2），λ1是离子复合物的检测波长，λ2是游离指示剂的检测波长。Min和Max表示小和大离子浓度。Q：λ2波长检测下的F_min/F_max的比值。K_d是离子-指示剂复合物的解离常数。

3.2 对于单波长指示剂比如Mag-Fluo-4，通过以下公式来确定K_d值，F指的是在单波长下测定的荧光强度。

在上述公式中，需注意F值依赖于指示剂浓度，但R值不依赖于指示剂浓度。

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应用示例（来自文献，仅用作参考）

文献一、Kolisek M et al. Mrs2p is an essential component of the major electrophoretic Mg2+ influx system in mitochondria. EMBO J. 2003 Mar 17;22(6):1235-44.

使用方法（荧光分光光度计测定[Mg²⁺]_m和 [Ca²⁺]_m）：1）用DMSO配制Mag-fura 2 AM（0.5mM）或Fura 2 AM (0.5mM)储存液，工作浓度分别是5和10μM。2）线粒体分别加载Mag-fura 2 AM或Fura 2 AM测定游离线粒体内的Mg²⁺或Ca²⁺浓度，[Mg²⁺]_m和 [Ca²⁺]_m。25℃，在SH缓冲液内分别用Mag-fura 2 AM（5μM）或Fura 2 AM（10μM），和5ul Pluronic F-127孵育线粒体（0.5mg/ml），35min。之后用SH缓冲液清洗线粒体2次以去除多余探针。后，线粒体再孵育35min使得探针完全水解。之后清洗两次再开始荧光测定。

通过用荧光分光光度计测定探针加载线粒体的荧光值来确定离子浓度，大激发波长分别为340和380nm，发射波长为509nm。所有的测定在25℃进行，3ml比色皿内含2ml线粒体悬浮液（0.5mg 蛋白/ml）。

Fig 1. Original record of an Mg2+ measurement with yeast mitochondria and of the calibration procedure. Mag‐fura 2 emission at a wavelength of 510 nm was measured upon excitation at 380 and 340 nm (standard excitation wavelength for the free mag‐fura 2 and for the ion‐bound mag‐fura 2, respectively). (A) Single wavelength fluorescence intensities of mag‐fura 2‐loaded yeast mitochondria as a function of time and [Mg2+]e. Measurements were started with mag‐fura 2‐loaded mitochondria in essentially Mg2+‐free buffer (see Materials and methods). Mg2+ was added to final concentrations of 1, 5 and 10 mM. [Mg2+]e was raised to 25 mM before the addition of SDS, resulting in Rmax, and the addition of EDTA led to Rmin values. Inset: autofluorescence of mag‐fura 2‐unloaded mitochondria. (B) The 340/380 nm ratio of the fluorescence intensities shown in Figure 2A. Note that increases in the ratio are caused by an increase in the 340 nm intensity and a decrease in the 380 nm intensity, indicating that changes in the ratio are due in fact to alterations in the ratio of [Mg2+:mag‐fura 2]/[mag‐fura 2]. (C) Effect of an increase of the extramitochondrial [Ca2+] on the 340/380 nm ratio of the fluorescence intensities.

——Written/Edited by V. Shallan【】

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Mag-Fura-2 AM镁离子荧光探针

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