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AO/EB Double Staining Kit AO/EB双染试剂盒

吖啶橙（Acridine Orange，AO）；溴化乙锭（Ethidium Bromide, EB）；Apoptotic cell 凋亡细胞；Necrotic cells坏死细胞；Annexin V/PI 细胞凋亡双染；

产品描述

吖啶橙（Acridine Orange，AO）是一种异染的核酸结合染料，具细胞膜渗透性，通过插入或静电吸引的方式与DNA或RNA结合。当与双链DNA（dsDNA）结合发射绿色荧光（Ex/Em=502/525nm），与单链DNA（ssDNA）或RNA结合发射红色荧光（Ex/Em=460/650nm），少量结合呈橙红色荧光。溴化乙锭（Ethidium Bromide, EB）是一种多环芳烃荧光小分子和核酸插入剂，嵌合到双链DNA或RNA的碱基对内，无碱基特异性，呈红色荧光（（Ex/Em=518/605nm）。EB不具细胞膜渗透性。

吖啶橙（AO）和溴化乙锭（EB）常常联合使用来观察细胞核变化和凋亡小体形成，这些都是凋亡的特征。两者结合能区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。工作原理在于吖啶橙能同时染活细胞和死细胞，EB只能对丧失膜完整性的细胞进行染色。活细胞呈均匀的绿色。早期凋亡细胞呈绿色，并且在细胞核能看到亮绿色的点，由于染色体浓缩和核断裂。晚期凋亡细胞也会被EB着色，从而染成橙红色，但，与坏死细胞相比，晚期凋亡细胞会有浓缩和常常断裂的核。坏死细胞也被染成橙红色，但会有和活细胞相似的核形态，没有浓缩的染色体。

产品包装

注意事项

1）AO与EB都有一定毒性，请小心操作。

2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

1. 染色工作液的制备

于正式实验前，取吖啶橙染液（试剂A）、溴化乙锭染液（试剂B）、稀释缓冲液（试剂C），按照A:B:C=1:1:8的比例稀释成所需的AO/EB染色工作液。

2. 细胞准备

贴壁细胞：按照常规方法消化。于1000rpm离心5min，收集细胞沉淀，用PBS清洗一次。

悬浮细胞：于1000rpm离心5min，收集细胞沉淀，用PBS清洗一次。

之后用稀释缓冲液（试剂C）重悬细胞，细胞计数，调整细胞密度为0.5-5×10⁶个/ml。

3. 染色

每25μl细胞悬液中，加入2μl 新鲜制备的AO/EB染色工作液，轻轻混合均匀。室温孵育5~10min。

4. 观察

取干净载玻片，滴加5~10μl 染色的细胞悬液，盖上盖玻片。使用荧光显微镜的荧光素滤片和60倍放大的物镜来观察和计数。该测定至少重复三次，每次观察的总细胞至少100个。

【注意】：根据细胞类型选择理想的物镜放大倍数（更高或更低），前提是必须看清核形态。

应用示例（来自文献）：

文献：Dual AO/EB Staining to Detect Apoptosis in Osteosarcoma Cells Compared with Flow Cytometry.

染色方法：Dual fluorescent staining solution (1 μl) containing 100 μg/ml AO and 100 μg/ml EB (AO/EB) was added to each suspension and then covered with a coverslip. The morphology of apoptotic cells was examined and 500 cells were counted within 20 min using a fluorescent microscope (OLYMPUS). Dual acridine orange/ethidium bromide (AO/EB) staining method was repeated 3 times at least.

Fig. (A) 阴性对照细胞（正常细胞）：环形细胞核均匀分布在细胞中央。(B)实验组 (早期凋亡细胞): 吖啶橙（AO）染色后的细胞核呈黄绿色荧光，以月牙形或颗粒的形态聚集位于细胞的一边。(C) 实验组 (晚期凋亡细胞): 经EB染色后的细胞核呈橙红荧光，集中聚集且偏重定位。(D) 坏死细胞：坏死细胞体积增加，显示平整的橙红色荧光和不清晰的轮廓。细胞正要溶解或接近崩溃。

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