标签：线粒体自噬检测试剂盒

Dojindo,Mitophagy Detection Kit/Mtphagy/MD01,线粒体自噬检测试剂盒

Mitophagy 检测试剂盒针对哺乳动物细胞进行了优化。
线粒体是细胞质细胞器之一，在细胞中起着至关重要的作用，例如产生细胞活力的能量。最近，线粒体自噬似乎与去极化线粒体的积累诱导的阿尔茨海默病和帕金森病有关。线粒体自噬作为一种特异性消除系统，将由氧化应激和DNA损伤引起的功能失调的线粒体隔离到自噬体中，与溶酶体融合并通过消化降解。该试剂盒由Mtphagy Dye、线粒体自噬检测试剂和Lyso Dye组成。 Mtphagy Dye 积聚在完整的线粒体中，通过化学键固定在其上，并因周围条件的影响而呈现出微弱的荧光。当 Mitophagy 被诱导时，受损的线粒体与溶酶体融合，然后 Mtphagy Dye 发出高荧光。为了确认 Mtphagy Dye 标记的线粒体和溶酶体的融合，可以使用本试剂盒中包含的 Lyso Dye。E. Fang 等利用 mt-mKeima 检测了番茄碱诱导的 HeLa 细胞线粒体自噬。使用我们的 Mitophagy Detection Kit 3 在原代大鼠皮层神经元和人类 SH-SY5Y 神经细胞中也检测到 Mitophagy。如果蛋白质表达/转染不适合实验，Mitophagy Detection Kit 将是一种有效的替代方法。有关 Mtphagy Dye 组合物和示例的更多信息，请参阅以下出版物：Iwashita H、Torii S、Nagahora N、Ishiyama M、Shioji K、Sasamoto K、Shimizu S、Okuma K。新型荧光小分子。“ACS Chem Biol, 2017, doi: 10.1021/acschembio.7b00647。注：Mtphagy Dye 和 Lyso Dye 正在申请专利。

Simple Procedure

CCCP（羰基氰化物间氯苯腙）已添加到正常和 Parkin 表达的细胞中。在正常HeLa细胞(A)(B)中未观察到强荧光。另一方面，在加入CCCP(C)后18小时，Parkin表达的细胞中显示出强荧光。一些斑点与自噬标记 (GFP-LC3) 共定位。此外，当自噬抑制剂巴弗洛霉素添加到停车表达的细胞中时，观察到 Mtphagy 染料的荧光受到抑制（D）。因为添加巴弗洛霉素会增加溶酶体的 pH 值。

饥饿细胞中的线粒体自噬检测
在线粒体自噬诱导条件下，活的 HeLa 细胞与 Mtphagy Dye 和 Lyso Dye 共染色。将 Mtphagy Dye 添加到 HeLa 细胞中，细胞在饥饿条件下孵育 6 小时。在观察细胞之前，将溶酶体染色染料 Lyso Dye 添加到 HeLa 细胞中。 Mtphagy Dye 的荧光强度在饥饿的 HeLa 细胞中增加，但在正常细胞中不增加。此外，Mtphagy Dye 与 Lyso Dye 在饥饿细胞中共同定位。

实验示例：CCCP 诱导线粒体自噬
羰基氰化物间氯苯腙 (CCCP) 作为线粒体解偶联试剂与 Parkin 表达的 HeLa 细胞诱导线粒体自噬

将 HeLa 细胞接种在 μ-slide 8 孔 (Ibidi) 上，并在 5%-CO2 培养箱中于 37oC 培养过夜。细胞通过HilyMax转染试剂（代码#：H357）转染Parkin质粒载体，37℃孵育过夜。 Parkin 表达的 HeLa 细胞用 Hanks 的 HEPES 缓冲液洗涤两次，然后在 37oC 下与 250 μl 含有 100 nmol/l MitoBright Deep Red（代码#：MT08）的 100 nmol/l Mtphagy Dye 工作溶液一起孵育 30 分钟。用 Hanks’ HEPES 缓冲液洗涤细胞两次后，向孔中加入含有 10 μmol/l CCCP 的培养基。孵育 24 小时后，通过荧光显微镜观察线粒体自噬。去除上清液后，向细胞中加入 250 μl 1 μmol/l Lyso Dye 工作溶液，并在 37oC 下孵育 30 分钟。用 Hanks 的 HEPES 缓冲液洗涤细胞两次，然后通过共聚焦荧光显微镜观察 Mtphagy、Lyso Dye 和 MitoBright Deep Red 的共定位。

使用 Parkin 表达的 HeLa 细胞（上图）和正常 HeLa 细胞（下）A、E）Mtphagy Dye 的荧光图像观察线粒体自噬； B, F) Lyso Dye 的荧光图像；C, G) MitoBright Deep Red 的荧光图像； D、H) 合并图像

线粒体膜电位变化的线粒体自噬诱导和检测
使用 Mitophagy 检测试剂盒 (MD01, MT02) 和 JC-1 MitoMP 检测试剂盒 (MT09) 将羰基氰化物间氯苯肼 (CCCP) 处理的表达 Parkin 的 HeLa 细胞中的线粒体状况与未处理的细胞进行比较。

结果：未经处理的细胞未检测到线粒体自噬，膜电位正常。然而，在处理的细胞中观察到膜电位和线粒体自噬的降低。

Experimental ConditionTransfection of Parkin plasmid to HeLa cells– HileyMax (H357) was used to transfect Parkin plasmid to HeLa cells (Parkin plasmid/HilyMax reagent: 0.1μg/0.2 μL) by incubating overnight.Detection of Mitophagy1. Add 0.1 μmol/L Mtphagy working solution to Parkin expressing HeLa cells and incubated for 30 minutes at 37 ℃2. Wash cells with HBSS3. Add 10 μg/mL CCCP/MEM solution and inclubate for 2 hours at 37 ℃4. Observe under fluorescence microscopeDetection of Mitochondrial Membrane Potential1. Add 10 μg/mL CCCP/MEM solution to Parkin expressing HeLa cells and incubate for 1.5 hours at 37 ℃2. Add 4 μmol/L JC-1 working solution (final concentration: 2 μmol/L) and incubate for 30 minutes at 37 ℃3. Wash with HBSS and add Imaging Buffer Solution.4. Observe under fluorescence microscope

Detecting Condition:

Mitophagy DetectionEx: 561 nm, Em: 570-700 nm

Mitochondrial Membrane Potential DetectionGreen Ex: 488 nm, Em: 500-550 nmRed Ex: 561 nm, Em: 560-610 nm

FCM

Mitochondrial contribution to lipofuscin formation

Procedure (Adherent cell):

1.Cells were washed twice with DMEM and afterwards incubated at 37 °C for 30 min with 100 nmol Mtphagy Dye diluted in DMEM.

2.After this incubation cells were again washed twice with DMEM followed by the addition of complete DMEM.

3.The induction of mitophagy was then accomplished by the addition of 20 µM carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) for 24 h. Subsequently, fibroblasts were trypsinized and fluorescence intensity of Mtphagy Dye was measured by flow cytometry at 488 nm excitation and 655–730 nm emission.

Age-associated changes in human CD4+ T cells point to mitochondrial dysfunction consequent to impaired autophagy

Procedure (Suspension cell):

  1. Briefly, 2×106 CD4+ T cells were divided into four tubes containing serum-free RPMI.
  2. Tube #1 was for unstained cells that followed all washing and media changing processes.
  3. 100 nmol/l Mtphagy Dye working solution was added to tubes #2, 3, 4 and then all tubes were incubated at 37°C for 30 minutes.
  4. The cells were then washed with serum-free medium. After discarding the supernatant, complete medium (RPMI 1640, 10% FBS, 1% P/S/G) was added to all the tubes.
  5. Ten μmol/l CCCP (Sigma-Aldrich) mitophagy-inducer was then added to tube #3, 100 nmol/l Bafilomycin A1 (Sigma-Aldrich) autophagy inhibitor was added to tube #4.
  6. All tubes were then incubated at 37 °C for 18 hours.
  7. After 18 hours, cells were washed with FACS buffer.
  8. Mtphagy Dye fluorescence detection by flow cytometry (BD FACSCANTO II) was performed using 488 nm for excitation and 695 nm for emission (this corresponds to the PerCP cy5.5 channel). Data were analyzed using FLOWJO software (version 10).

Microplate Reader

PINK1 depletion sensitizes non-small cell lung cancer to glycolytic inhibitor 3-bromopyruvate: involvement of ROS and mitophagy

No. Sample Instruments Publications
1) Cell(HeLa, MEF) Fluorescencemicroscope H. Iwashita, H. T. Sakurai, N. Nagahora, M. Ishiyama, K. Shioji, K. Sasamoto, K. Okuma, S. Shimizu, and Y. Ueno, “Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux.”, FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567.
2) Cell(HeLa) Fluorescencemicroscope T. Sakata, A. Saito and H. Sugimoto, “In situ measurement of autophagy under nutrient starvation based on interfacial pH sensing.”, Scientific Reports., 2018, 8, 8282.
3) Cell(HS-MM) Fluorescencemicroscope Y. Egawa, C. Saigo, Y. Kito, T. Moriki and T. Takeuchi , “Therapeutic potential of CPI-613 for targeting tumorous mitochondrial energy metabolism and inhibiting autophagy in clear cell sarcoma.”, PLoS One., 2018, 13, (6), e0198940.
4) Cell(HaCaT) Fluorescencemicroscope S. Abe, S. Hirose, M. Nishitani, I. Yoshida, M. Tsukayama, A. Tsuji and K. Yuasa , “Citrus peel polymethoxyflavones, sudachitin and nobiletin, induce distinct cellular responses in human keratinocyte HaCaT cells.“, Biosci. Biotechnol. Biochem. ., 2018, 82, (12), 1347.
5) Cell(KGN) Fluorescencemicroscope W. Yuping, M. Congshun, Z. Huihui, Z. Yuxia, C. Zhenguo and W. Liping, “Alleviation of endoplasmic reticulum stress protects against cisplatin-induced ovarian damage.”, Reprod. Biol. Endocrinol., 2018,doi: 10.1186/s12958-018-0404-4.
6) Cell(BmN) Fluorescencemicroscope S. Xue, F. Mao, D. Hu, H. Yan, J. Lei, E. Obeng, Y. Zhou, Y. Quan, and W. Yu, “Acetylation of BmAtg8 inhibits starvation-induced autophagy initiation.”, Mol. Cell Biochem., 2019,doi: 10.1007/s11010-019-03513-y.
7) Cell(HeLa) Fluorescence microscope F. Hongbao,Y. Shankun, C. Qixin, L. Chunyan, C. Yuqi, G. Shanshan, B. Yang, T. Zhiqi, L. Z. Amanda, T. Takanori, C.Yuncong, G. Zijian, H. Weijiang and D. Jiajie , “De Novo-Designed Near-Infrared Nanoaggregates for Super-Resolution Monitoring of Lysosomes in Cells, in Whole Organoids, and in Vivo.”, ACS Nano, 2019, 13, (12), 1446.
8) Cell(RT-7) FlowCytometer E. Sasabe, A. Tomomura, N. Kitamura and T. Yamamoto, “Metal nanoparticles-induced activation of NLRP3 inflammasome in human oral keratinocytes is a possible mechanism of oral lichenoid lesions.”, Toxicol In Vitro., 2020, 62, 104663.
9) Cell(multiple myeloma) Fluorescence microscope J. Xia, Y. He, B. Meng, S. Chen, J. Zhang, X. Wu, Y. Zhu, Y. Shen, X. Feng, Y. Guan, C. Kuang, J. Guo, Q. Lei, Y. Wu, G. An, G. Li, L. Qiu, F. Zhan and W. Zhou, “NEK2 induces autophagy-mediated bortezomib resistance by stabilizing Beclin-1 in multiple myeloma.”, Mol Oncol, 2020, DOI: 10.1002/1878-0261.12641.
10) Cell(Human L2) Fluorescence microscope Q. Xu, W. Shi, P. Lv, W. Meng, G. Mao, C. Gong, Y. Chen, Y. Wei, X. He, J. Zhao, H. Han, M. Sun and K. Xiao, “Critical role of caveolin-1 in aflatoxin B1-induced hepatotoxicity via the regulation of oxidation and autophagy.”, Cell Death Dis., 2020, 11(1), 6.
11) Cell(Cardiomyocytes) Fluorescence microscope L Cui, LP Zhao, JY Ye, L Yang, Y Huang, X.P. Jiang, Q. Zhang, JZ. Jia, DX. Zhang and Y. Huang, “The Lysosomal Membrane Protein Lamp2 Alleviates Lysosomal Cell Death by Promoting Autophagic Flux in Ischemic Cardiomyocytes.“, Front Cell Dev Biol, 2020,DOI:10.3389/fcell.2020.00031.
12) Cell(IPEC-J2) Fluorescence microscope Y Yang, J Huang, J Li, H Yang and Y. Yin, “The Effects of Butyric Acid on the Differentiation, Proliferation, Apoptosis, and Autophagy of IPEC-J2 Cells..”, Curr. Mol. Med., 2020, 20(4), 307.
13) Cell(Fibroblasts, Kidney epithelial cells) Fluorescence microscope M. M. Ivanova, J. Dao, N. Kasaci, B. Adewale, J. Fikry and O. G. Alpan  , “Rapid Clathrin-Mediated Uptake of Recombinant α-Gal-A to Lysosome Activates Autophagy”, Biomolecules , 2020,  10(6), 837.
14) Cell(NHEKs) Fluorescence microscope S. Ikeoka and A. Kiso  , “The Involvement of Mitophagy in the Prevention of UV-B-Induced Damage in Human Epidermal Keratinocytes “, J. Soc. Cosmet. Chem. Jpn., 2020,  54(3), 252.

 

与 Keima-Red 相比，该套件有什么优势？
我们的试剂盒使用小分子荧光探针，可以在不表达荧光蛋白的情况下检测线粒体自噬现象。我可以将 Mitophagy 检测试剂盒与固定细胞一起使用吗？
不，该试剂盒适用于活细胞，因为 Mtphagy Dye 会在完整的线粒体中积累。为什么不能将 Mtphagy 染料和 Lyso 染料混合在一起？
由于 Lyso 染料的荧光在长时间染色后会消失，如果将两种染料一起添加，Lyso 染料不会发出足够的荧光来进行双重染色。因此，在观察之前添加溶血染料。

我可以用 Mitophagy 检测试剂盒检测多少次？
对于 96 孔板格式（100 ul/孔），该试剂盒足以容纳 5 个板。对于 35 mm 培养皿格式 (2ml)，该试剂盒足以进行 25 次检测。

成功检测的一些技术技巧是什么？
1. 在诱导线粒体自噬之前加入 Mtphagy Dye 工作溶液（Mtphagy Dye 在完整的线粒体中积累）2。使用适当的过滤器 – Mtphagy 染料：Ex.500-560 nm、Em.670-730 nm 用于显微镜检测3。阳性对照使用 CCCP 或 FCCP*FCCP 或 CCCP 浓度：10 uM-30 uM，37℃孵育时间 3 小时 FCCP：羰基氰 4-（三甲基甲氧基）苯腙CCCP：羰基氰 3-氯苯腙4。如果可用，请使用共聚焦显微镜

培养基中的血清对活细胞成像敏感吗？
是的，它很敏感，因为 Mtphagy Dye 和 Lyso Dye 都会干扰培养基中的血清。请使用 Hank 的 HEPES 缓冲液或无血清培养基。

酚红有什么作用？
图 1. 荧光显微镜观察到的酚红引起的背景。但是，使用共聚焦显微镜时，酚红没有影响。我们强烈建议在检测线粒体自噬时使用共聚焦显微镜。

推荐的过滤器是什么？
Mtphagy Dye: Ex.500~560 nm, Em.670~730 nm, Lyso Dye: Ex.350~450 nm, Em.500~560 nm

使用 MitoBright Deep Red 进行多重染色有什么需要注意的地方吗？
Mtphagy Dye 的发射与 MitoBright Deep Red 的发射重叠。您需要在不激发 MitoBright Deep Red 的波长处激发 Mtphagy Dye。[示例] 染色 MitoBright Deep Red 后，在以下 Mtpahgy 染料和 MitoBright Deep Red 的激发和发射滤光片上观察细胞。

在 Mtphagy Dye 通道中检测到来自 MitoBright Deep Red 的荧光。请参阅以下部分以将光谱重叠减少到可接受的水平。1。更换激发滤光片

请将 Mtphagy Dye 的激发波长更改为大约 500 nm，并确保 MitoBright Deep Red 不被激发。 2.调整荧光检测的激发强度和灵敏度

请调整激发强度或检测灵敏度，直到不再检测到来自其他染料的荧光。之后，请仔细检查您是否可以检测到 Mtphagy Dye 的荧光。

如何检查光谱重叠使用 Mtphagy Dye、Lyso Dye 和 MitoBright Deep Red1 的示例。在 3 个不同的培养皿或孔中准备细胞（培养皿/孔 1-3 号）。2。在 1 号培养皿/孔中加入 Mtphagy Dye，在无血清培养基的 2 号培养皿/孔中加入 MitoBright Deep Red。 3.将细胞在 37°C 下孵育 30 分钟。 4.在 mitophagy 诱导条件下培养细胞（例如饥饿诱导 mitophagy）5。用无血清培养基将 Lyso Dye 添加到 3 号（3 号是培养皿/孔中仅包含在细胞中）。 6。将细胞在 37°C 下孵育 30 分钟。 7.在适当的 Ex./Em 处检测荧光。每种试剂的波长。Mtphagy 染料：例如。 500-560nm，时间。 670-730nmLyso 染料：ex. 350-450nm，时间。 500-560nmMitoBright 深红：ex. 640纳米，时间。 656-700nm8。检查是否在其他试剂的检测条件下观察到荧光。（例如：对于 Dish/well No.1，请检查在 Lyso 染料和 MitoBright Deep Red 的检测条件下观察到荧光。）