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NMY51酵母感受态细胞,双膜系统,双膜系统利用NMY51酵母菌

NMY51酵母感受态细胞：双膜系统利用NMY51酵母菌，能直接转化质粒进行蛋白突变验证或筛库实验。转化标志为TRP1，leu2-3。报告基因为HIS3，ADE2和LacZ。NMY51的选择性生长筛选通过营养缺陷报告基因（HIS3，ADE2）进行，之后通过LacZ报告基因进行β-半乳糖分析的定量或半定量筛选，三个独立的报告基因由不同的启动子调控，有助于降低假阳性几率。
NMY51 Chemically Competent Cell

酵母菌化学感受态细胞

Dualmembrane system 双膜系统；Dualsystems Biotech；Y1HGold；pBT3-STE；pPR3-STE；NMY51；X-α-Gal；Aureobasidin A （AbA）；金担子素；

货号 产品名称 规格
MF2360-1000UL NMY51 Chemically Competent Cell 酵母菌化学感受态细胞 10×100μl
MF2360-5000UL NMY51 Chemically Competent Cell 酵母菌化学感受态细胞 50×100μl

产品组分：

组分编号 组分名称 保存

货号（规格）
MF2360-1000UL MF2360-5000UL
MF2360-A NMY51 Chemically Competent Cell -80℃ 10×100μl 50×100μl
MF2360-B pGADT7 Control Vector (10ng/μl) -80℃ 10μl   10μl  
MF2360-C Carrier DNA (10μg/μl) -20℃ 100μl  500μl 
MF2360-D PEG/LiAC Solution +4℃ 5ml 25ml


产品描述

双膜系统（Dualmembrane system）是由Dualsystems Biotech公司开发的专门筛选跨膜蛋白间相互作用的筛选技术，该技术利用分离的泛素系统直接检测天然状态下膜蛋白间的相互作用，是目前为止为一用来检测膜蛋白间相互作用的酵母双杂交系统。

双膜系统利用NMY51酵母菌，能直接转化质粒进行蛋白突变验证或筛库实验。转化标志为TRP1，leu2-3。报告基因为HIS3，ADE2和LacZ。NMY51的选择性生长筛选通过营养缺陷报告基因（HIS3，ADE2）进行，之后通过LacZ报告基因进行β-半乳糖分析的定量或半定量筛选，三个独立的报告基因由不同的启动子调控，有助于降低假阳性几率。

双膜系统的工作原理在于：泛素分子量很小，由76个氨基酸残基组成。泛素作为降解信号分子，能够连接另一个蛋白的N端，之后被泛素专一性蛋白酶（ubps）识别，导致与泛素相连蛋白被酶降解。泛素可人为分成两个部分：N端（Nub）和C端（Cub）。首先，将泛素Nub的三位异亮氨酸突变成甘氨酸（Nubi突变为NuBG），通过这种方式Cub的亲和力明显降低，避免Cub和Nub自我结合或靠近的可能性。其次，Cub与合成的LEXA-VP16转录激活因子融合成融合蛋白Cub-lexa-vp16。正常情况下，NuBG不与Cub结合，ubps也不能识别分离的泛素，转录激活因子也不会被切下来。后，将待测蛋白分别与NuBG和Cub融合，形成bait融合蛋白（bait-cub-lexa-vp16）和prey融合蛋白（prey-NuBG）。如果bait和prey发生相互作用，促使NuBG和Cub的相互接近，从而被ubps识别，导致LEXA-VP16的解离，进入核内，进而激活报告基因的转录。该系统能使用四种Bait质粒：pBT3-N，pBT3-SUC，pBT3-STE，pBT3-C，筛选标志是Leu。三种prey质粒：pPR3-C ，pPR3-SUC，pPR3-STE，筛选标志是Trp。

本品为经特殊工艺制备的NMY51酵母菌化学感受态细胞，用pGADT7质粒检测转化效率＞104cfu/μg DNA。且在-80℃能稳定保存三个月。

基因型

MATa, his3Δ200, trp1-901, leu2-3, 112, ade2, LYS2::(lexAop)4-HIS3, ura3::(lexAop)8-lacZ, ade2::(lexAop) 8-ADE2, GAL4

使用方法

 

1. Carrier DNA于使用前通过加热处理使其变性为单链状态，方法如下：95-100℃ 水浴或金属浴3min，快速插入冰中，静置3min。重复一次。

2. 取100 µl冰上融化的NMY51化学感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5 µg，单链Carrier DNA 10 µl，PEG/LiAc 500µl，用枪吹打几次充分混匀，30℃水浴30 min（在15min时翻转6-8次混匀）。

3. 之后将管子放42℃水浴15 min（在7.5min时翻转6-8次混匀）。

4. 5000 rpm离心40s弃上清，用400 µl ddH2O重悬沉淀，离心30s弃上清。

5. 用50 µl ddH2O重悬，涂板，放入29℃培养48-96 h。

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萤火虫萤光素酶报告基因检测 探针与染色 萤火虫萤光素酶（Firefly Luciferase）普遍用作一种报告基因来研究基因调控和功能，以及用于药物筛选。由于哺乳动物细胞或组织缺乏任何内源性的荧光素酶活性和生物发光的天然属性，萤火虫荧光素酶是一种非常灵敏的遗传报告子。

Firefly Luciferase Reporter Gene Assay Kit

萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒

Firefly Luciferase 萤火虫荧光素酶；Photinus pyralis；报告基因检测；D-luciferin sodium D-荧光素钠盐；ATP生物发光检测；CAS：61970-00-1；

产品名称 产品编号 规格
Firefly Luciferase Reporter Gene Assay Kit

萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒

 MF4001-100T 100T
MF4001-1000T 1000T

萤火虫萤光素酶（Firefly Luciferase）普遍用作一种报告基因来研究基因调控和功能，以及用于药物筛选。由于哺乳动物细胞或组织缺乏任何内源性的荧光素酶活性和生物发光的天然属性，萤火虫荧光素酶是一种非常灵敏的遗传报告子。萤火虫萤光素酶是一种分子量~61kD的蛋白，在ATP、镁离子和氧气存在的条件下，可以催化萤光素（Luciferin）氧化成氧化荧光素（Oxyluciferin），在此氧化过程中释放出生物萤光（Bioluminescence）。这一荧光可通过化学发光仪（Luminometer）或液闪测定仪进行测定。

 本萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒（Firefly Luciferase Reporter Gene Assay Kit），正是利用萤光素为底物来检测细胞内萤火虫萤光素酶活性的试剂盒，操作简单、快速、灵敏且呈良好的线性关系。

产品组分

组分编号 组分名称

产品货号（规格）

MF4001-100T

MF4001-1000T
MF4001-A Cell Culture Lysis Buffer细胞裂解液 60ml 10×60ml
MF4001-B Luciferase Assay Reagent萤火虫荧光素酶检测试剂 10ml 10×10ml

保存与运输方法

保存：细胞裂解液置于4℃保存三个月有效，-20℃保存一年有效；萤火虫荧光素酶检测试剂置于-20℃六个月有效，-80℃避光保存一年有效；

运输：冰袋运输。

注意事项

  • 为了保证萤火虫荧光素酶检测试剂的稳定性，建议初次使用进行适当分装，避光冻存，尽量降低反复冻融次数。内部测试显示反复冻融三次对测定结果无明显影响。
  • 由于温度对酶活性有影响，测定时样品和试剂均需达到室温后再进行测定。
  • 为取得加测定结果，用单管的化学发光仪测定时，样品和试剂混合后到测定前的时间需尽量控制在相同时间，比如30s内；使用具化学发光测定功能的多功能荧光酶标仪时，hao xian把样品全部加好，然后统一加入萤火虫荧光素酶检测试剂。
  • 样品和试剂混合后，必须等待1~2s，再进行测定。测定时间通常为10s，根据情况可适当延长或缩短，但同一批样品宜使用相同的测定时间。
  • 为避免由于质粒转染细胞效率差异引起的误差，可同时转入海肾荧光素酶报告基因质粒作为内参，用我司的双荧光素酶报告基因检测试剂盒（货号：MF4010-100T）进行检测。
  • 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

一、 细胞裂解

1.1 将含转染有报告基因质粒的细胞内的培养基去除，对于贴壁细胞直接加PBS轻轻洗涤，对于悬浮细胞，低速离心收集细胞后用PBS轻轻洗涤。

1.2 将细胞裂解液充分混匀后，按下表用量来加入适量细胞裂解液，之后将培养板放在微型振荡器上室温震荡15min，以充分裂解细胞。

培养皿类型 96孔板 48孔板 24孔板 12孔板 6孔板
细胞裂解液（μl/孔） 100 150 200 300 500
【注①】：如果荧光素酶的表达水平比较低，可尝试使用更少的裂解液，例如6孔板的每孔用量可减少到100μl。【注②】：细胞裂解后可立即测定荧光素酶活，也可置于-70℃冻存，避免反复冻融，待以后再测定。冻存样品需充分融解，达到室温后再进行酶活测定。

1.3 将充分裂解后的产物于10,000~15,000rpm室温离心3~5min，取上清用于测定。

二、 荧光素酶检测

2.1 融解萤光素酶检测试剂，并达到室温。

2.2 按仪器说明书开启化学发光仪或具有检测化学发光功能的多功能酶标仪，设定参数，测定间隔设为2s，测定时间设为10s。

2.3 将细胞裂解产物按照20~100μl的体积加入测量管中（如果裂解产物足够，请加入100μl；如果裂解产物不足可以适当减少用量，但同批裂解产物的使用量宜保持*）。

2.4 加入100μl萤光素酶检测试剂，用枪打匀或用其它适当方式混匀后测定RLU（Relative light unit）。以细胞裂解液为空白对照。

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