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Calcein AM/PI Double Stain Kit 活细胞/死细胞双染试剂盒

产品关键词：
Calcein, AM 钙黄绿素AM；Propidium Iodide (PI) 典化丙啶；Live/Dead Cell Double Staining Kit 活细胞/死细胞双染色试剂盒；SYTOX Red Dead Cell Stain 死细胞染色；溴乙啡锭二聚体（EthD-1）；CAS NO：148504-34-1；

产品信息

试剂盒组分

产品描述

本钙黄绿素AM/典化丙啶双染试剂盒(Calcein AM/PI Double Stain Kit)，包含钙黄绿素AM和典化丙啶两种荧光染料，用于对活细胞和死细胞的同时染色，即是常称的活细胞/死细胞双染试剂盒（Live/Dead Cell Double Staining Kit）。

试剂盒工作原理在于：Calcein AM（钙黄绿素乙酰甲酯），CAS NO：148504-34-1，一种具高度亲脂性和细胞膜渗透性的活细胞荧光染料。本身不具荧光，一旦进入细胞后，被细胞内酯酶水解生成钙黄绿素（calcein），产生亮绿色荧光（Ex/Em= 490nm/515nm）。因此，Calcein AM仅对活细胞进行染色。另一方面，典化丙啶（PI），一种细胞核染料，不能穿透完整的活细胞膜。只能穿透死细胞的不规则区域进入细胞核，然后嵌入DNA双螺旋区域，产生红色荧光（Ex/Em= 535nm/617nm）。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。而用545 nm激发，仅可观察到死细胞。结合这些特点，Calcein, AM和PI经常被结合用作活细胞和死细胞的双重染色。

测定方法与结果呈现
1）   荧光显微镜（Fluorescent Microscopy）
检测方法：490±10 nm激发能同时看到呈黄–绿色荧光的活细胞和红色的死细胞。另，545nm激发可能只能看到呈红色的死细胞。
 
Fig 1. Fluorescence microscopy images of calcein-AM (green) and propidium iodide (red). The macrophages differentiated into osteoclasts on (a) nt-TiO2 and (b) nt-TiO2-P for 4 days. Cells were then examined by fluorescence microscopy (Axioplan 2, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) with 490-nm excitation for the simultaneous monitoring of viable and dead cells. [Reference: Tae-Hyung Koo et al. Immobilization of pamidronic acids on the nanotube surface of titanium discs and their interaction with bone cells. Nanoscale Res Lett. 2013; 8(1): 124.]

2）  荧光酶标仪（Fluorescent Plate Reader）
检测方法：96孔透明底的黑色酶标板（96-well black plate with clear bottom），Calcein检测的激发波长为490nm，发射波长为520nm；PI检测的激发波长为530nm，发射波长为617nm；
 
Fig 2. HeLa cells were seeded at 1,500 to 100,000 cells/well in a 96-well black plate with clear bottom and incubated overnight. Cells were exposed to Triton X-100 (0.05%, 10 min) and cell viability/toxicity was measured using Calcein AM-PI double stain kit. Relative fluorescence for Calcein AM (left) and Propidium Iodide (right) are shown.

3）  流式细胞仪（Flow cytometer）
检测方法：流式细胞仪，Calcein检测的激发/发射波长为488/535nm，PI的激发和发射波长为488/620nm。
  
Fig 3. Quantification of calcein and PI staining in WT cells and in cells incubated with increasing concentrations of miltefosine: 20μM, 40μM or 100μM for 24h. [Reference: Basmaciyan L et al. Calcein+/PI- as an early apoptotic feature in Leishmania. PLoS One. 2017 Nov 7;12(11):e0187756.]

注意事项
1）    由于Calcein-AM对湿度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量，分装密封保存。Calcein-AM工作液必须现配现用。
2）   典化丙啶（PI）有一定的致癌性，操作时一定要注意防护。若接触到皮肤，需要立即用自来水清洗。
3）    为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法maokangbio
一、试剂准备
1.1 1×反应缓冲液（Assay Buffer）的配制
从低温冰箱内取出10×Assay Buffer，根据单次用量无菌条件取出适量，用去离子水（dH₂O）做10倍稀释以得到1×Assay Buffer。
1.2    1×染色工作液（Stain Buffer）的配制
1）   先将低温保存的Calcein AM溶液 (4 mM)和PI溶液（1.5 mM）室温回温至少20min，使其充分融化。注意：*次使用时建议对储存液根据单次用量分装，特别是Calcein AM，以减少反复冻融次数。
二、染色步骤

常见问题
1、   该试剂盒适用任何细胞类型？
基本上适用于任何含酯酶活性的动物细胞。植物和细菌细胞因含有细胞壁，Calcein-AM不能进入因此无法染色。有可能对原生质体进行染色。
2、   用相同浓度有可能对所有哺乳动物细胞进行染色？
对所有细胞都用相同的浓度是很不合理的。Calcein-AM和PI的zui加工作浓度根据细胞类型差异很大。有必要根据具体细胞来确定zui价染料浓度。参考说明书染料工作浓度优化方法。
3、   Calcein-AM对细胞有毒？
与其他相似的活细胞染料比较，Calcein-AM基本无毒（毒性zui小）。见文献EL.S.D.Clerck,et.al., J.Immunol.Methods, 172,115-124(1994)
4、   试剂盒如何保存？
密封-20℃保存。Calcein-AM遇潮会水解，因此直至管子温度达到室温后才能开盖。使用后拧紧盖子。用缓冲液或者培养基稀释后的染色工作液需即刻使用。不能保存后使用。

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