日期：2022年3月18日

D-荧光素钾盐，D-虫荧光素钾盐；D-Luciferin potassium

分子式：C11H7KN2O3S2    分子量：318.41

一：背景简介：哺乳动物发光，一般是将萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)基因整合到需观察细胞的染色体DNA上，以表达荧光素酶，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株，当细胞分裂、转移、分化时，荧光素酶也会得到持续稳定的表达。标记后的荧光素酶只有在活细胞内才会产生发光现象，并且发光强度与标记细胞的数目呈线性相关。除萤火虫荧光素酶外，有时也会用到海肾荧光素酶(renilla luciferase)。二者的底物不同，萤火虫荧光素酶的底物是荧光素(D-luciferin,常见钾盐或者钠盐)。二者的发光波长也不一样，前者发光波长在540-600 nm,后者发光波长在460-540nm。荧光素所发的光更容易透过组织，在体内代谢较慢，而且特异性好。所以大部分活体成像实验采用萤火虫荧光素酶基因作为报告基因。

D-荧光素（D-Luciferin）是荧光素酶（Luciferase）的常用底物，普遍应用于整个生物技术领域，特别是体内活体成像技术。其作用机制是在ATP和荧光素酶的作用下，荧光素（底物）能够被氧化发光。当荧光素过量时，产生的光量子数与荧光素酶的浓度呈正相关性（见下图）。将携带荧光素酶编码基因（Luc）的质粒转染入细胞后，导入研究动物如大、小鼠体内，之后注入荧光素，通过生物发光成像技术（BLI）来检测光强度变化，从而实时监测疾病发展状态或药物的治疗功效等。也可以利用ATP对此反应体系的影响，根据生物发光强度的变化来指示能量或生命体征。

D-荧光素也常用于体外研究，包括荧光素酶和ATP水平分析；报告基因分析；高通量测序和各种污染检测。目前有三种产品形式：D-荧光素（游离酸），D-荧光素盐（钠盐和钾盐）。主要差别在于溶解特性：前者的水溶性以及缓冲体系的溶解性都较弱，除非溶于弱碱如低浓度NaOH和KOH溶液。可溶于甲醇和DMSO；后者能够易溶于水或缓冲液中，使用方便，溶剂无毒性，特别适合体内实验。配成溶液后的这三种产品，在绝大多数的应用上都没有实质性的差别。  根据文献及客户使用习惯，目前使用荧光素钾盐的较为常见。

自主研发的D-荧光素钾盐，具有纯度高，溶解性好，发光强度高衰减慢等特点，媲美进口产品。目前已经实现批量化生产，批产量高达100克以上。

产品用途：D-Luciferin作为荧光素酶的底物，存在于多种发光生物体中。在ATP和荧光素酶的催化作用下，荧光素被氧化，产生蓝绿色的光(560nm)，当底物过量时，产生的光量子数与荧光素酶的浓度呈正相关。编码荧光素酶的Luc基因是植物、细菌、哺乳动物细胞的常见报告基因。由于没有背景干扰，因此可以很容易检测出低至0.02 pg水平的荧光素酶。广泛应用与活体成像报告基因检测等领域。

二：D荧光素钾产品技术指标及操作方法

技术指标

操作方法

体外生物发光试验荧光素试剂的制备
材料
—D-荧光素，钾盐（）
—无菌纯水()
—完全培养基（自行配置）
步骤
1. 用无菌水制备100X荧光素原液（15mg/ml），轻轻颠倒摇动至荧光素完全溶解。混匀后立即使用或分装后-20℃冻存。
2. 将D-luciferin，potassium salt 溶解于预热好的组织培养基中制备成浓度为150 μg/ml的工作液。用组织培养基1∶100稀释储存液，配置工作液(终浓度150μg/mL)。
3. 去除培养细胞的培养基。
4. 图像分析前，向细胞培养板中添加1×荧光素工作液，然后进行图像分析。
—注射器滤膜过滤除菌，0.2 μ m
*提示：成像前在37℃下对细胞进行短时间孵育可增强信号。

活体成像分析
材料
—D-荧光素，钾盐（）
—D-PBS,不含钙、镁（细胞培养级）()
1：配制溶液

使用无菌D-PBS（w/o Ca2+ ;Mg2+）配制D-荧光素钾盐溶液（15mg/ml），0.22µm滤膜过滤除菌（避光），分装后于-20℃或-80℃冷冻保存，避免反复冻融。使用时4℃融化，实验前平衡至室温（避光）

2：注射量取决于注射方式，具体如下：

3： 注射入体内10-20 min（待光信号达到最强稳定平台期），再进行成像分析。
注意：建议对每只动物模型都需要建立荧光素酶动力学曲线，从而确定最高信号检测时间和信号平台期。保存和操作的过程中都要避光。另外水溶性储存液过滤除菌后，可以-20℃或-80℃分装冻存，避免反复冻融。如果有条件，对储存液充氮气或氩气（防止氧化），稳定性和保存时间更长，长达1年。 注射方式，动物类型以及体重等都会影响信号的发射，因此建议每次实验都要做荧光素酶动力学曲线，确定最佳信号平台期和最佳的检测时间。荧光素钾盐和荧光素钠盐应用上没有差别，两者的差别在于物理性状上如外形和溶解性。钠盐的水溶性高于钾盐。从目前发表的文献来看，钾盐的使用率远高于钠盐，尤其是体内实验。两者功效相同。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

三：产品测试结果展示及文献发表

1 结构确定（HNMR核磁氢谱）

H-NMR谱图，由以上谱图可以看出，产品结构正确。

2 纯度检测（HPLC高效液相）

HPLC谱图，由以上谱图可以看出，产品纯度非常高。

3 荧光强度验证

采用美国BioTek HTX多功能荧光酶标仪，对D荧光素钾盐进行验证，对照产品为进口P公司。双盲对照，结果显示，俩者在荧光强度及动力学指标上无显著差异

图A：D-LuciferinK萤光信号强度检测

图B： D-LuciferinK萤光信号稳定性（动力学）检测。等量的萤火虫萤光素酶，分别加入含有300μg/ml D-LuciferinK 的经典萤火虫萤光素酶发光缓冲溶液（含 ATP、CoA、Mg2+ ），从反应初始时刻持续追踪萤光信号60s，可以发现D-LuciferinK的萤光信号强度与信号稳定性均与进口公司无显著差别。（仪器：BioTek HTX）

4 溶解性测试

室温条件下，用纯水作为溶剂 测试溶解性，30MG/ML浓度，易溶解，澄清度良好。

5 活体成像实例。

6 细胞实验D-荧光素钾盐体外生物发光试验

材料：

—D-荧光素钾盐（）
—无菌纯水（）
—完全培养基（自行配制）

步骤：
1. 贴壁细胞：将细胞接种于培养板中孵育数小时或过夜，使细胞贴壁。悬浮细胞：可以将细胞接种于培养板后直接进行后续操作，无需孵育。如果倍增时间相对较短，则应考虑倍增时间进行细胞计数。

2.将15mg荧光素钾盐溶解于1ml无菌水中，制备成100X荧光素储备液（15mg/ml），轻轻颠倒摇动至荧光素钾盐完全溶解。混匀后立即使用或分装后-20℃冻存。

3. 用预热好的细胞培养基1∶100稀释100X荧光素储备液（15mg/ml），配制成荧光素工作液（终浓度150μg/ml），即配即用。

4. 去除培养板中的培养基。

5. 在成像前，将适量荧光素工作液加入细胞中，然后进行图像分析。注意：成像前在37℃下对细胞进行短时间孵育可增强信号。孵育时间取决于特定的细胞类型。一般来说孵育10分钟就足够了，根据需要进行测试和调整。

6. 每隔10分钟，最多40分钟，使用VILBER FUSION FX成像系统检查体外生物发光，确定动力学曲线并找出细胞的峰值成像时间点。

结果：（见下图A）

图A：D-luciferin体外生物发光动力学曲线。使用D-luciferin检测转染pML-NFκB-Fluc2-Neo质粒（）后的293T细胞，VILBER FUSION FX成像系统下每5min检测萤光信号一次，持续追踪40min。动力学曲线显示，D-luciferin作为底物的细胞生物发光衰减较慢，40min后萤光信号强度仅衰减25%左右。

7 近期使用D荧光素钾盐发表文献举例

(1). Development of a hypoxia-triggered and hypoxic radiosensitized liposome as a doxorubicin carrier to promote synergetic chemo-/radio-therapy for glioma

期刊：BIOMATERIALS 影响因子：10.273

(2)Hypoxia-responsive lipid-poly-(hypoxic radiosensitized polyprodrug) nanoparticles for glioma chemo- and radiotherapy.

期刊：Theranostics；影响因子：8.06

(3)Theranostic size-reducible and no donor conjugated gold nanocluster fabricated hyaluronic acid nanoparticle with optimal size for combinational treatment of breast cancer and lung metastasis

期刊：JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE  影响因子：7.901

(4)Hypoxia-responsive ionizable liposome delivery siRNA for glioma therapy.

期刊：International Journal of Nanomedicine  影响因子：4.47

(5)Self-assembled angiopep-2 modified lipid-poly (hypoxic radiosensitized polyprodrug) nanoparticles delivery TMZ for glioma synergistic TMZ and RT therapy

期刊：DRUG DELIVERY  影响因子：3.829

(6)Angiopep-2 Modified Cationic Lipid-Poly-Lactic-Co-Glycolic Acid Delivery Temozolomide and DNA Repair Inhibitor Dbait to Achieve Synergetic Chemo-Radiotherapy Against Glioma

期刊：JOURNAL OF NANOSCIENCE AND NANOTECHNOLOGY  影响因子：1.093

备注：所有报价均已含国内快递费及发票费用。库存情况可能有所变动，请与我们销售人员确认为准，价格情况请直接联系我们销售人员。

我司所售出产品仅供于科研研究用途（非临床科研研究），每次销售产品行为都适用于我司网上所列明的。

质量标准：≥98%,BR

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DAPI； 4，’6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐；DAPI dihydrochloride

分子式：C16H15N5·2HCl   分子量：350.25

简介： DAPI，即2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride，也称DAPI dihydrochloride。DAPI的中文名称是4，6-联脒-2-苯基吲哚，是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料。其作用机理与溴化乙锭（EB）等染色剂的机理类似：它们与DNA双螺旋的凹槽部分可以发生相互作用，从而与DNA的双链紧密结合。和双链DNA结合后可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光。和EB(ethidium bromide)相比，对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好UV（紫外光）的激发波长是356nm，使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。DAPI染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。用于细胞核染色时，推荐的DAPI工作浓度为0.5-10μg/ml。

物理性状及指标：
外观：……………………黄色结晶性粉末
溶解性：…………………溶于水(20mg/ml)
密度：……………………1.4100
含量：……………………>95%

Ex (nm)：………………DAPI 340  ；DAPI-DNA 358

Em (nm) ：……………DAPI 488  ；DAPI-DNA 461

用途及描述：科研试剂，广泛应用于分子生物学，药理学等科研方面，严禁用于人体 。DAPI染色溶液(DAPI Staining Solution)是适用于所有常见细胞和组织细胞核染色的染色液。可以直接用于固定细胞或组织的细胞核染色。也用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。和双链DNA结合后可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光。与EB(ethidium bromide)相比，对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。

配制母液
用双蒸水溶解，终浓度为1mg/ml。本产品不可以用缓冲液直接溶解。-20℃可保存1年，建议分装保存，避免反复冻融。
使用方法推荐(仅供参考)
1.配制工作液：用双蒸水或PBS稀释母液，配制成所需要的工作的浓度（0.5-10μg/ml）。
2.固定的细胞或组织染色：
对于固定的细胞或组织样品，固定后，适当洗涤去除固定剂。DAPI染色通常在其他染色的最后进行。如果不需要进行其它染色，则直接进行DAPI 染色。
a)对于贴壁细胞或组织切片：加入适量DAPI染色液，覆盖住样品即可。
对于悬浮细胞：至少加入待测染色样品体积3倍的染色液，混匀。室温放置3-5分钟。
b)吸除DAPI染色液，用TBST、PBS或生理盐水洗涤2-3次，每次3-5分钟。
c)直接在荧光显微镜下观察或封片后荧光显微镜下观察。激发波长358nm，发射波长461nm。
3. 活细胞或组织染色：
a)细胞培养物中加入适量DAPI染色液，约1/10细胞培养基体积，必须充分覆盖住待染色的样品。通常对于六孔板一个孔需加入1ml染色液，对于96孔板一个孔需加入100μl染色液。
b)在 37℃培养细胞 10～20 分钟。
c)用 PBS或合适的缓冲液洗细胞两次。
d)直接在荧光显微镜下观察或封片后荧光显微镜下观察。激发波长358nm，发射波长461nm。

注意事项：

●荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽量当天完成检测。

●为减缓荧光淬灭可以使用抗荧光淬灭封片液。（货号MA0221）

●DAPI对人体有一定刺激性，请注意适当防护。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

储存条件：2-8℃，避光防潮密闭干燥。

运输条件：常温运输

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DCFH-DA 活性氧ROS荧光探针；2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯；H2DCFDA

分子式：C24H16Cl2O7    分子量 ：487.29

简介：2’, 7’-二氯四氟乙烷双乙酸盐（2，7-双氯荧光素蛋白乙酸盐）被细胞酯酶水解成2,7-双氯四氟双烷（2，7-双氯荧光素蛋白）然后主要通过双氧水氧化产生荧光素。在氧化应激期间二氢荧光素双乙酸盐可能增加大范围的氧化反应。这类探针广泛的用于检测细胞氧化还原反应的过程。

物理性状及指标：

外观：……………………类白色至淡黄色屑状

激发波长Ex (nm) ：…………………… 504

发射波长Em (nm) ：……………………529

溶解性：……………………DMSO: ≥ 150 mg/mL；Water：Insoluble

生物活性：

用途及描述：科研试剂，广泛应用于分子生物学，药理学等科研方面，严禁用于人体。2’, 7’-二氯四氟乙烷双乙酸盐（2，7-双氯荧光素蛋白乙酸盐）被细胞酯酶水解成2,7-双氯四氟双烷（2，7-双氯荧光素蛋白）然后主要通过双氧水氧化产生荧光素。在氧化应激期间二氢荧光素双乙酸盐可能增加大范围的氧化反应。这类探针广泛的用于检测细胞氧化还原反应的过程。

数据展示：

■荧光显微镜观察，用活性氧阳性对照刺激细胞后荧光明显增强。

阳性对照组                               普通实验组

储存条件：-20℃，避光防潮密闭干燥。

运输条件：2~8℃运输

【注意】

●我司产品为非无菌包装，若用于细胞培养，请提前做预处理，除去热原细菌，否则会导致染菌。

●部分产品我司仅能提供部分信息，我司不保证所提供信息的权威性，以上数据仅供参考交流研究之用。

CAS 号：4091-99-0

英文名字：2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯

Di-2-ANEPEQ (JPW 1114)膜电位荧光探针；
Di-2-ANEPE用来测定快速膜电位改变。ANEP染料属于快速反应膜电位染料类。它们的光学反应总够快能检测刺激细胞中瞬时跨膜电位的改变，能证明膜电势依赖激发光谱的转换。

Di-2-ANEPEQ is used for monitoring fast membrane potential changes. ANEP dyes belong to the class of the fast-response membrane potential dyes. Their optical response is fast enough to detect transient membrane potential changes in excitable cells where they demonstrate a membrane potential-dependent shift in excitation spectra. This feature allows the measurement of membrane potential changes by excitation ratio. These dyes are weakly fluorescent in aqueous media, and become strongly fluorescent upon binding to lipophilic environments (such as membranes). In general, fast-response probes operate by means of a change in their electronic structure, and consequently their fluorescence properties, in response to a change in the surrounding electric field. Their optical response is sufficiently fast to detect transient (millisecond) potential changes in excitable cells, including single neurons, cardiac cells and intact brains. However, the magnitude of their potential-dependent fluorescence change is often small; fast-response probes typically show a 2-10% fluorescence change per 100 mV.

储存条件：-20℃

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Di-8-ANEPPS膜电位荧光探针；

Di-8-ANEPES用来测定快速膜电位改变。ANEP染料属于快速反应膜电位染料类。它们的光学反应总够快能检测刺激细胞中瞬时跨膜电位的改变，能证明膜电势依赖激发光谱的转换。这个特性可以通过激发率的改变检测膜电势的改变。这些探针在水溶液中具有微弱的荧光，绑定于脂质环境变成强烈的荧光（例如细胞膜）。由于它的磺化基团，Di-8-ANEPPS比其他ANEPP染料更少受细胞内化的影响。总之，快速反应探针的操作通过改变电子结构导致它们的荧光属性以适应周围电场的改变。它们的光学反应总够快能检测刺激细胞中，例如单神经元，心脏细胞，和完整大脑中毫秒跨膜电位的改变。然而，它们电势依赖荧光改变的数量级一直很小，快速反应探针能代表性的展示2-10%／100 mV.荧光改变。

储存条件：-20℃

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DiBAC4(5)细胞膜电位荧光探针；DiBAC4(5) ;[Bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)pentamethine oxonol]
DiBAC4(5)是一种带有长波长激发和发射光灵敏的膜电位探针。它是一种慢响应的探针，用于测定细胞跨膜电位。总的来说，慢响应探针表现的电位改变依赖于它们跨膜的分布，同时还伴随着荧光的改变。它们巨大的光学反应比快响应的探针要大的多（一般每mV引起1%荧光改变）。慢响应探针，包括羰花青阳离子，罗丹明和氧离子，它们都适合用于细胞非应激性平均膜电位的检测；这些非应激性细胞活动通常由细胞呼吸作用，离子通道渗透性，药物结合和其它一些因素导致。

储存条件：-20℃

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产品简介：染料 DiD, DiI, DiO 和 DiR 是一类亲脂性荧光染料家族，用于标记细胞膜和疏水性组织。这是一类环境敏感型荧光染料，当它们与膜结合或者与亲脂性生物分子（例如蛋白质，虽然在水中其荧光强度很弱）结合时，其荧光强度显著增强。它们具有很高的淬灭系数，偏光依赖性和很短的激发寿命。一旦应用于细胞中，这种染料会在细胞内质膜中逐步扩散，导致在其最佳浓度条件下，将整个细胞膜染色。它们不同的荧光颜色：DiI（橙色荧光）、DiO（绿色荧光）、DiD（红色荧光）、DiR（深红色荧光），为活细胞多色彩荧光成像分析和流式细胞术提供了一种便捷的工具。
DiD（红色荧光）可以用来对活细胞进行成像和流式分析。DiD可以用633 nm He–Ne 激光器激发，有着比 DiI 更长的激发波长和发射波长，在细胞和组织染色中更有价值。
基本信息：

产品应用标准实测：（由细胞生物学项目组独立完成）
本品配成 5mM 溶液后为深蓝色液体溶液澄清度且颜色检测无可见异物；然后进行荧光染色检测：工作条件：荧光显微镜，C6 细胞，400×，工作浓度 5μM。
结果：经细胞膜荧光染色，在40倍物镜下可看到清晰荧光。此浓度下在荧光显微镜下看到的荧光亮度亦足以用于共聚焦检测。

储存条件：-20℃，避光防潮密闭干燥

运输条件：2~8℃运输

操作说明（仅供参考）

1. 染色液制备

（1）配置DMSO或EtOH 储存液：储存液用 DMSO或EtOH配置浓度1～5 mM。
【注】未使用的储存液分装储存在-20℃，避免反复冻融。
（2）工作液制备：用合适的缓冲液（如：无血清培养基，HBSS或PBS）稀释储存液，配制浓度为1～5 μM的工作液。
【注】工作液最终浓度建议根据不同细胞系和实验体系来优化。建议从推荐浓度的10倍范围内开始最优浓度的摸索。

1. 悬浮细胞染色

（1）加入适当体积的染色工作液重悬细胞，使其密度为1×106/mL。
（2）37 ℃孵育细胞 2～20min，不同的细胞最佳培养时间不同。可以20min作为起始孵育时间，之后优化体系以得到均一的标记结果。
（3）孵育结束，按1000～1500 rpm离心5min。
（4）倾倒上清液，再次缓慢加入37℃预热的生长培养液重悬细胞。
（5）重复（3），（4）步骤两次以上。
3. 贴壁细胞的染色
（1）将贴壁细胞培养于无菌盖玻片上。
（2）从培养基中移走盖玻片，吸走过量培养液，将盖玻片放在潮湿的环境中。
（3）在盖玻片的一角加入100μL的染料工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞。
（4）37 ℃孵育细胞 2～20min，不同的细胞最佳培养时间不同。可以20min作为起始孵育时间，之后优化体系以得到均一的标记结果。
（5）吸干染料工作液，用培养液洗盖玻片2～3次，每次用预温的培养基覆盖所有细胞，孵育5～10min，然后吸干培养基。
4. 显微镜检测
DiD，DiO，DiI，DiR滤光器的选择参见表1。 DiD染色可见红色荧光。
5.流式细胞仪检测
经DiD，DiO，DiI，DiR染色的细胞可分别用流式细胞仪的FL1，FL2，FL3或FL4通道检测。

表1. 细胞膜荧光探针相关产品

我司所售出产品仅供于科研研究用途（非临床科研研究），每次销售产品行为都适用于我司网上所列明的。

产品简介：DiI 即 DiIC18(3)，全称为 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3’tetramethylindocarbocyanine perchlorate，是最常用的细胞膜荧光探针之一，呈现橙红色荧光。染料 DiI, DiD, DiO 和 DiR 是一类亲脂性荧光染料家族，用于标记细胞膜和疏水性组织。这是一类环境敏感型荧光染料，当它们与膜结合或者与亲脂性生物分子（例如蛋白质，虽然在水中其荧光强度很弱）结合时，其荧光强度显著增强。它们具有很高的淬灭系数，偏光依赖性和很短的激发寿命。一旦应用于细胞中，这种染料会在细胞内质膜中逐步扩散，导致在其最佳浓度条件下，将整个细胞膜染色。它们不同的荧光颜色：DiI（橙红色荧光）、DiO（绿色荧光）、DiD（红色荧光）、DiR（深红色荧光），为活细胞多色彩荧光成像分析和流式细胞术提供了一种便捷的工具。DiI可以用标准的 TRITC 滤光片检测。
DiI 通常不会影响细胞的生存力因此被广泛用于正向或逆向，活的或固定的神经等细胞或组织的示踪剂或长期示踪剂 (long-term tracer)。被 DiI 标记的神经细胞在体外培养的条件下可以存活长达 4 周，在体内可以长达一年。DiI 在被固定的神经元细胞膜上的迁移速率为0.2-0.6 mm/day，在活的神经元细胞膜上的的迁移速率为 6mm/day。
DiI 除了用于细胞膜荧光标记外，还可用于检测细胞的融合和粘附，检测发育或移植过程中细胞的迁移，通过FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) 检测脂在细胞膜上的扩散，检测细胞毒性和标记脂蛋白等。
基本信息：

产品应用标准实测：（由细胞生物学项目组独立完成）
本品配成 5mM 溶液后为紫粉色液体，溶液澄清度且颜色检测无可见异物；然后进行荧光染色检测：工作条件：荧光显微镜，C6 细胞，400×，工作浓度 5μM。
结果：经细胞膜荧光染色，在40倍物镜下可看到清晰荧光。此浓度下在荧光显微镜下看到的荧光亮度亦足以用于共聚焦检测。

储存条件：-20℃，避光防潮密闭干燥

运输条件：2~8℃运输

操作说明（仅供参考）

1. 染色液制备

（1）配置DMSO或EtOH 储存液：储存液用 DMSO或EtOH配置浓度1～5 mM。
【注】未使用的储存液分装储存在-20℃，避免反复冻融。
（2）工作液制备：用合适的缓冲液（如：无血清培养基，HBSS或PBS）稀释储存液，配制浓度为1～5 μM的工作液。
【注】工作液最终浓度建议根据不同细胞系和实验体系来优化。建议从推荐浓度的10倍范围内开始最优浓度的摸索。

1. 悬浮细胞染色

（1）加入适当体积的染色工作液重悬细胞，使其密度为1×106/mL。
（2）37 ℃孵育细胞 2～20min，不同的细胞最佳培养时间不同。可以20min作为起始孵育时间，之后优化体系以得到均一的标记结果。
（3）孵育结束，按1000～1500 rpm离心5min。
（4）倾倒上清液，再次缓慢加入37℃预热的生长培养液重悬细胞。
（5）重复（3），（4）步骤两次以上。
3. 贴壁细胞的染色
（1）将贴壁细胞培养于无菌盖玻片上。
（2）从培养基中移走盖玻片，吸走过量培养液，将盖玻片放在潮湿的环境中。
（3）在盖玻片的一角加入100μL的染料工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞。
（4）37 ℃孵育细胞 2～20min，不同的细胞最佳培养时间不同。可以20min作为起始孵育时间，之后优化体系以得到均一的标记结果。
（5）吸干染料工作液，用培养液洗盖玻片2～3次，每次用预温的培养基覆盖所有细胞，孵育5～10min，然后吸干培养基。
4. 显微镜检测
DiI，DiD，DiO，DiR滤光器的选择参见表1。 DiD染色可见红色荧光。
5.流式细胞仪检测
经DiI，DiD，DiO，DiR染色的细胞可分别用流式细胞仪的FL1，FL2，FL3或FL4通道检测。

表1. 细胞膜荧光探针相关产品

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DiO即DiOC18(3)，全称为3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate，是最常用的细胞膜荧光探针之一，呈现绿色荧光。DiO是一种亲脂性膜染料，进入细胞膜后可以侧向扩散逐渐使整个细胞的细胞膜被染色。
DiO在进入细胞膜之前荧光非常弱，仅当进入到细胞膜后才可以被激发出很强的荧光。DiO被激发后
可以发出绿色的荧光，DiO和磷酯双层膜结合后的激发光谱和发射光谱参考下图。其中，最大激发波长为484nm，最大发射波长为501nm。

DiO的分子式为C53H85ClN2O6，分子量为881.72，CAS number为34215-57-1。
DiO可以溶解于无水乙醇、DMSO和DMF，溶解度约为1-2.5mg/ml。发现较难溶解时可以适当加热，并用超声处理以促进溶解。
DiO被广泛用于正向或逆向的，活的或固定的神经等细胞或组织的示踪剂或长期示踪剂(long-termtracer)。DiO通常不会明显影响细胞的生存力(viability)。DiO对于细胞膜染色的荧光强度通常要低于DiI，有时对于某些经过固定的组织的染色效果欠佳。
DiO除了最简单的细胞膜荧光标记外，还可以用于检测细胞的融合和粘附，检测发育或移植过程中细胞迁移，通过FRAP(Fluorescence Recovery After Photobleaching)检测脂在细胞膜上的扩散，检测细胞毒性和标记脂蛋白等。
用于细胞膜荧光标记时，DiO的常用浓度为1-30μM，最常用的浓度为5-10μM。DiO可以直接染色活
的细胞或组织，染色时间通常为5-20分钟。对于固定的细胞或组织，通常宜使用配制在PBS中的4%多聚甲醛进行固定，使用其它不适当的固定液会导致荧光背景较高。

保存条件：
-20℃，避光防潮密闭干燥。

运输条件：

2~8℃运输
注意事项：
荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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DiR细胞膜荧光探针;DiR碘化物
分子式： C63H101IN2  分子量：1013.4
产品介绍：
染料DiI, DiO, DiD 和 DiR是一类亲脂性荧光染料家族，用于标记细胞膜和疏水性组织。这是一类环境敏感型荧光染料，当它们与膜结合或者与亲脂性生物分子(例如蛋白质，虽然在水中其荧光强度很弱)结合时，其荧光强度显著增强。它们具有很高的淬灭系数，偏光依赖性和很短的激发寿命。一旦应用于细胞中，这种染料会在细胞内质膜中逐步扩散，导致在其最佳浓度条件下，将整个细胞染色。
它们不同的荧光颜色：DiI（橙色荧光）、DiO（绿色荧光）、DiD（红色荧光）、DiR（深红色荧光），为活细胞多色彩荧光成像分析和流式细胞术提供了一种便捷的工具。DiO和DiI可以分别与标准的FITC和TRITC滤光器一同使用，其中，DiO可以被633 nm He-Ne激光激发，并且具有比DiI更长的激发和发射光波长，为标记细胞和组织的那些本身就具有本底荧光的染料提供了非常卓越的替代品。
DiR在活体成像或者示踪中非常有用，因为它们所发射的红外光可以高效地穿过细胞和组织，并且在红外光范围内，其本底荧光水平很低。

技术资料：
1.Ex(nm)：748
2.Em(nm)：780
3.分子量：1013.39
4.溶剂：DMSO

使用方法：
1.DiD，DiO，DiI，DiR和DiS细胞膜染色液制备
(1)配置DMSO或EtOH 储存液：储存液用 DMSO或EtOH配置浓度1～5 mM。
注意：未使用的储存液保存在-20 oC，避免反复冻融。
(2)工作液制备：用合适的缓冲液(如：无血清培养基，HBSS或PBS)稀释储存液，配制浓度为1～5 µM的工作液。
注意：工作液的最终浓度是根据不同细胞和实验的经验来配制。可以从推荐浓度的十倍以上寻找最佳条件。
2.悬浮细胞染色
(1)悬浮细胞密度为 1 × 106/mL加入到工作液中。
(2)在37 ℃培养细胞 2～20分钟，不同的细胞最佳培养时间不同。
(3)染色细胞试管在1000～1500转离心5分钟。
(4)倾倒上清液，再次缓慢加入预温37℃的培养液。
(5)重复(3)，(4)步骤两次以上。
3.粘壁细胞的染色
(1)使粘壁的细胞在无菌实验室培养。
(2)从培养基中移走盖玻片，吸走过量培养液，将盖玻片放在潮湿的环境中。
(3)在盖玻片的一角加入100μL的染料工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞。
(4)在37 ℃培养细胞 2～20分钟，不同的细胞最佳培养时间不同。
(5)吸干染料工作液，用培养液洗盖玻片2～3次，每次用预温的培养基覆盖所有细胞，培养5～10分钟，然后吸干培养基。
4.流式细胞仪的检测
DiD，DiO，DiI，DiR和DiS 染色的细胞可以分别用经典的FL1，FL2，FL3和FL4流式细胞仪检测。
储存条件：-20℃干燥避光保存，有效期一年。

运输条件：2~8℃运输

检测条件：
(1) DiR工作液浓度：5µM

(2) 染色条件：贴壁细胞：37 ℃染色工作液孵育细胞20分钟，用培养液洗2次，每次用预温的培养基覆盖所有细胞，培养10分钟。 悬浮细胞：37 ℃染色工作液孵育细胞20分钟，1000～1500转离心5分钟，倾倒上清液，再次缓慢加入预温37℃的培养液，重复两次。

(3) 检测仪器：小动物活体成像仪（VILBER, FUSION FX）；Ex/Em=750/850nm

检测数据

细胞名称	结果图（左：进口对照；右：）		结论
Hela			DiR碘化物标记细胞膜后荧光更亮，效果更好，荧光稳定性与进口对照相似。
				Jurkat
							MCF-7
NIH/3T3

DiR细胞膜荧光探针;DiR碘化物的溶解性，DiR细胞膜荧光探针;DiR碘化物在水中的溶解性，DiR细胞膜荧光探针;DiR碘化物在生理盐水中的溶解性，DiR细胞膜荧光探针;DiR碘化物在PBS缓冲液中的溶解性，DiR细胞膜荧光探针;DiR碘化物在DMSO、乙醇等有机溶剂中的溶解性，DiR细胞膜荧光探针;DiR碘化物在细胞实验方面的应用，DiR细胞膜荧光探针;DiR碘化物在大鼠等动物实验方面的应用。以上相关信息请直接联系大连技术公司，我司将随货提供部分的参考信息。（注意，部分产品我司仅能提供部分信息，我司不保证所提供信息的权威性，仅供客户参考交流研究之用）
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英文名字：DiR iodide [1,1‘-dioctadecyl-3,3,3’,3‘-tetramethylindotricarbocyanine iodide]

cas号：100068-60-8

DiSBAC2(3)细胞膜电位荧光探针；DiSBAC2(3); [Bis-(1,3-diethylthiobarbituric acid)trimethine oxonol]
DiSBAC2(3)是一种带有长波长激发和发射光灵敏的膜电位探针。它是一种慢响应的探针，用于测定细胞跨膜电位。总的来说，慢响应探针表现的电位改变依赖于它们跨膜的分布，同时还伴随着荧光的改变。它们巨大的光学反应比快响应的探针要大的多（一般每mV引起1%荧光改变）。慢响应探针，包括羰花青阳离子，罗丹明和氧离子，它们都适合用于细胞非应激性平均膜电位的检测；这些非应激性细胞活动通常由细胞呼吸作用，离子通道渗透性，药物结合和其它一些因素导致。

储存条件：-20℃
操作说明（仅供参考）
1.Prepare cells:
1.1 For adherent cells: Plate cells overnight in growth medium at 40,000 to 80,000 cells/well/100 µL for 96-well plates or 10,000 to 20,000 cells/well/25 µL for 384-well plates.
1.2 For non-adherent cells: Centrifuge the cells from the culture medium and then suspend the cell pellets in equal amount of HHBS and MP dye-loading solution (see Step 2.2 below) at 125,000 to 250,000 cells/well/100 µL for 96-well poly-D lysine plates or 30,000 to 60,000 cells/well/25 µL for 384-well poly-D lysine plates. Centrifuge the plates at 800 rpm for 2 minutes with brake off before the experiments.
Note: Each cell line should be evaluated on an individual basis to determine the optimal cell density for the intracellular calcium mobilization.
2.Prepare DiSBAC2(3) dye-loading solution (for 1 plate):
2.1 Prepare a 10 to 30 mM stock solution of DiSBAC2(3) in high-quality, anhydrous DMSO. The stock solution should be used promptly; any remaining solution need be aliquoted and frozen at < -20 oC.
Note: Avoid repeated freeze-thaw cycles, and protect from light.
2.2 Prepare a 2X DiSBAC2(3) dye-loading solution: On the day of the experiment, either dissolve DiSBAC2(3) solid in DMSO or thaw an aliquot of the DiSBAC2(3) stock solution to room temperature. Prepare a 2X working solution of 20 to 40 µM in Hanks and 20 mM Hepes buffer (HHBS) or buffer of your choice, pH 7 with 0.04% to 0.08% Pluronic® F-127 (Cat. # 20053) and 2 mM Trypan Red Plus™ (Cat. # 2456). Mix them well by votexing. This working solution is stable for at least 2 hours at room temperature.
3.Run Membrane Potential Assay:
3.1 Add 100 µL/well (96-well plate) or 25 µL/well (384-well plate) DiSBAC2(3) dye-loading solution (from Step 2.2) into the cell plate.
Note1: If your screen compounds interfere with growth medium and serum factors, replace the growth medium with equal volume of HHBS buffer before adding the DiSBAC2(3) dye-loading solution. Alternatively, cells can be grown in serum-free conditions.
Note 2: Do NOT wash the cells after dye loading.
3.2 Incubate the dye-loading plate in a cell incubator for 30 to 60 minutes.
Note: In some cases, incubation at room temperature for 30 to 60 min may work better.
3.3 Prepare the compound plates by using HHBS or your desired buffer.
3.4 Run the membrane potential assay by monitoring the fluorescence intensity at Ex/Em = 540/590 nm (Cat. # 21414).
Note: It is important to run the signal test before your experiment. Different instruments have their own intensity range. Adjust the signal test intensity to the level of 10% to 15% of the maximum instrument intensity counts. For example, the maximum fluorescence intensity count for FLIPR-384 is 65,000, so the instrument settings should be adjusted to have its signal test intensity around 7,000 to 10,000
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DiSBAC2(5)细胞膜电位荧光探针; DiSBAC2(5); [Bis-(1,3-diethylthiobarbituric acid)pentamethine oxonol]
DiSBAC 2（5）是一个被广泛用于测量许多生物体中膜电位敏感的应膜电位探针。一般来说，反应慢的探针随其跨膜的分布变化而荧光变化。其光学反应的幅度比快速反应的探针（每毫伏通常为1％的荧光变化）大得多。慢探针包括阳离子carbocyanines，罗丹明类和阴离子oxonols，适用于检测变化引起的呼吸活性，离子通道的通透性，药物结合以及其他因素nonexcitable细胞的平均膜电位。

储存条件：-20℃
操作说明（仅供参考）
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DMS

用途及描述：科研试剂，蛋白交链与修饰

储存条件：

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EGTA AM钙离子螯合剂
C26H40N2O18；分子量：668.6
溶解性：溶于DMSO
EGTA是最为被广泛使用的钙离子选择性的螯合剂。它与钙离子形成的复合物比与镁离子形成的复合物要稳定100,000倍。它被用来制备钙缓冲液和控制钙离子的浓度。EGTA, AM是EGTA的乙酰甲酯衍生物，通过AM法，能被轻易负载到细胞中。

储存条件：-20℃
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使用说明（仅供参考）
1.Load Cells with Calcium Indicator AM Esters:
AM esters are the non-polar esters that readily cross live cell membranes, and rapidly hydrolyzed by cellular esterases inside live cells. AM esters are widely used for loading a variety of polar fluorescent probes into live cell non-invasively. However, cautions must be excised when AM esters are used since they are susceptible to hydrolysis, particularly in solution. They should be reconstituted in high-quality, anhydrous dimethylsulfoxide (DMSO). DMSO stock solutions should be stored desiccated at -20 °C and protected from light. Under these conditions, AM esters should be stable for several months.  
Following is our recommended protocol for loading AM esters into live cells. This protocol only provides a guideline, and should be modified according to your specific needs.
a)Prepare a 2 to 5 mM AM esters stock solution in high-quality, anhydrous DMSO.
b)On the day of the experiment, either dissolve calcium indicators solid in DMSO or thaw an aliquot of the indicator stock solutions to room temperature. Prepare a working solution of 2 to 20 µM in the buffer of your choice (such as Hanks and Hepes buffer) with 0.04% Pluronic® F-127. For most cell lines we recommend the final concentration of calcium indicators be 4-5 uM. The exact concentration of indicators required for cell loading must be determined empirically. To avoid any artifacts caused by overloading and potential dye toxicity, it is recommended to use the minimal probe concentration that can yield sufficient signal strength.
c)If your cells (such as CHO cells) containing the organic anion-transports, probenecid (2–5 mM) or sulfinpyrazone (0.2–0.5 mM) may be added to the the dye working solution (final in well concentration will be 1-2.5 mM for probenecid, or 0.1 -0.25 mM for sulfinpyrazone) to reduce the leakage of the de-esterified indicators.
d)Add equal volume of the dye working solution (from Step b or c) into your cell plate.
e)Incubate the dye-loading plate room at temperature or 37 °C for 20 minutes (especially Fluo-8 AM) to 2 hours, and then incubate the plate at room temperature for another 30 minutes.
Note1: Decreasing the loading temperature might reduce the compartmentalization of the indictor.
Note2: Incubate the Cal-520 AM longer than 2 hours gives better signal intensity for some cell lines.
f)Replace the dye working solution with HHBS or buffer of your choice (containing an anion transporter inhibitor, such as 1 mM probenecid, if applicable) to remove excess probes.
g)Run the experiments at desired Ex/Em wavelengths (see Table 1).
2.Measure Intracellular Calcium Responses:

Figure 1. Response of endogenous P2Y receptor to ATP in CHO-M1 cells without probenecid. CHO-M1 cells were seeded overnight at 40,000 cells per 100 µL per well in a 96-well black wall/clear bottom costar plate. 100 µl of 4 µM Fluo-3 AM, Fluo-4 AM or Cal 520® AM in HHBS were added into the wells, and the cells were incubated at 37 °C for 2 hour. The dye loading medium were replaced with 100 µl HHBS, 50 µl of 300 µM ATP were added, and then imaged with a fluorescence microscope (Olympus IX71) using FITC channel.

Figure 2. ATP-stimulated calcium response of endogenous P2Y receptor in CHO-K1 cells measured with Cal-520® or Fluo-4 AM. CHO-K1cells were seeded overnight in 50,000 cells per 100 µL per well in a 96-well black wall/clear bottom costar plate. 100 µL of 5 µM Fluo-4 AM or the Cal-520® AM with (A) or without (B) 2.5 mM probenecid was added into the cells, and the cells were incubated at 37oC for 2 hours.  ATP (50µL/well) was added by FlexStation (Molecular Devices) to achieve the final indicated concentrations.

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FDA活细胞荧光示踪探针;二乙酸荧光素；荧光素二乙酸酯
分子式 ：C24H16O7     分子量：416.38

简介：Fluorescein diacetate 是一种细胞渗透性的酯酶底物。Fluorescein diacetate 可作为人谷胱甘肽硫转移酶 Pi (hGSTP1-1) 的荧光底物。

物理性状及指标：

外观：…………………白色至微黄色粉末

熔点：…………………200-203 °C(lit.)

溶解性：…………………DMSO: ≥ 48 mg/mL；丙酮：25 mg/mL

纯度：……………………>97%（HPLC）

吸光度：…………………Ex (nm)494；Em (nm)521

敏感性：…………………对空气敏感

生物活性

用途及描述：科研试剂，广泛应用于分子生物学，药理学等科研方面，严禁用于人体。FDA是一种非荧光性疏水性荧光素衍生物，它可以穿透细胞膜进入细胞，通过细胞内酯酶催化水解二乙酸酯基团产生具有高强度的荧光产物荧光素。荧光分子在具有完整细胞膜的细胞内积累，因此这种绿色荧光可以作为一种细胞活力的标签。不具有完整细胞膜或者新陈代谢活性的细胞，不能在细胞内积累荧光产物，因此不能显现绿色荧光。FDA可以与染料PI联合使用，无活性的死细胞被PI着色，发出红色荧光；有活性的细胞PI无法着色，在FDA作用下，紧发出绿色荧光。这两种颜色可以很好的辨别死细胞与活细胞，与单一颜色检测相比，它提供了一种更为准确的活细胞定量检测方法

储液配置

经典实验操作（仅供参考）

使用方法举例（仅供参考）
1. 准备2-10mM DMSO 储备液 
溶解 4.2 mg 于 1 ml DMSO制备成10 mM 储备液(1 mg/ml 等同于 ~ 2.4 mM);

注意: 储备液请及时使用，剩余的储液请置于< -20℃，避免反复冻融，避光防潮密闭保存。

2.准备染料工作液

在使用前准备一个1～20μm的染料工作液。用Hanks和20 mm Hepes buffer（HHBS）或pH值为7的缓冲液稀释步骤1的DMSO原液，用涡旋把它们混合好。
3、用流式细胞仪或荧光显微镜分析细胞：

3.1用待测化合物处理细胞达所需时间。

3.2离心使细胞每管获得2-10个X105细胞。

3.3在染料工作溶液的500升中重新沉淀细胞（从步骤2）。

3.4在室温或37℃下用15℃或30℃的染料溶液孵育细胞，不受光照的影响。

3.5从细胞中去除染料工作溶液，用HHBS或您选择的缓冲液清洗细胞。在预加热的HHBS或培养基中500℃重培养细胞，获得每管2-10×105个细胞。

3.6用流式细胞仪（FL1通道）或荧光显微镜监测EX/EM＝490/520 nm处的荧光变化。
备注：对于细菌细胞染色：当试验溶液在一夜之间生长时，在培养基中稀释1:800稀释液是最有效的，但也可以使用新鲜的培养基或PBS。细菌悬浮液应以PBS稀释至每毫升105～107个生物。细菌可通过涂抹一毫升溶液至45μm滤光器（25mm）和真空过滤除去溶液，然后加入1ml染料溶液，并在室温下孵育5至10分钟。

储存条件：2-8℃，避光防潮密闭干燥

运输条件：常温运输

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简介：Fluorescein isothiocyanate (FITC) is an amine-reactive derivative of fluorescein dye that has wide-ranging applications as a label for antibodies and other probes, for use in fluorescence microscopy, flow cytometry and immunofluorescence-based assays such as Western blotting and ELISA. The isothiocyanate variety of fluorescein efficiently labels antibodies and other purified proteins at primary amines (lysine side chains)

储存条件：-20°C避光防潮密闭干燥。

运输条件：2~8℃运输

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