萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒

产品内容：

产品组成	100T	1000T
Cell Lysis Buffer (5x)	10mL	30mL
Firefly Luciferase Reaction Buffer	10mL	100mL
Firefly Luciferase Substrate	1 vial	1 vial-L
说明书	1 份	1 份

产品简介：

报告基因系统广泛应用于真核生物基因表达和细胞生理学研究，包括受体活性、转录因子、细胞内信号转导、mRNA处理和蛋白质折叠等。萤光素酶检测系统在灵敏度和操作简易性等方面都比传统的检测方法有了很大改进。萤火虫荧光素酶是一种分子量约为61kD的蛋白，在ATP、镁离子和氧气存在的条件下，可以催化萤光素底物（luciferin）氧化生成氧化萤光素（Oxyluciferin），在氧化过程中产生生物萤光。传统的萤光素酶检测中，酶和底物接触后，会形成快速衰减的闪光型萤光。萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒（Firefly Luciferase Reporter Assay Kit）有效改善了酶促反应过程的动力学稳定性，萤光强度稳定性可达30s以上，并可达到至少8个数量级的线性检测结果。该试剂盒可灵敏高效的检测受基因元件调控的Luciferase表达，通常将转录调控元件或5’启动子区克隆在firefly luciferase的上游，或把3′-UTR区克隆在Firefly luciferase的下游，构建成报告基因(reporter gene)质粒。然后转染细胞，经给药刺激等操作完毕后裂解细胞，测定萤光素酶活性。通过萤光素酶活性的高低来判断药物处理等操作对目的基因的转录调控作用。萤火虫萤光素酶催化Luciferin发光的最强发光波长为560nm。

 

数据展示

图1. Firefly luciferase萤光强度对比其他品牌。

 

 

图2.Firefly luciferase萤光信号稳定性（动力学）检测。从反应初始时刻持续追踪Firefly luciferase萤光信号30s，可以发现组的萤光信号近乎无衰减，信号稳定性极好，远远满足常规机器操作所需时长！（仪器参数：VILBER/化学发光/-90制冷CCD）

图3.组Luminescence-Firefly luciferase浓度梯度标准曲线。在仪器（BioTek HTX）允许的最大测试范围内，Firefly luciferase 萤光线性检测范围可达8个数量级，R2可达0.9996！（仪器：BioTek HTX）

 

 

TNFa	0ng/ml	2ng/ml	5ng/ml	10ng/ml	20ng/ml
Firefly:Lum	43038	44991	193674	952348	1835882
Firefly Normalized	1.000	1.045	4.500	22.128	42.657

 

图4.萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒实际应用举例。HEK-293T细胞转染了萤火虫萤光素酶NF-κB response reporter质粒。转染后12h，进行TNFα浓度梯度诱导，5h后收集细胞并进行裂解。酶标仪检测信号读值，对数据进行归一化处理，详见表格。以上结果提示Firefly luciferase 光强与给药浓度呈正相关，并且反应灵敏度高。（仪器：BioTek HTX）

 

使用说明：

1.自备材料

PBS；移液器或排枪；黑色酶标板；化学发光仪或酶标仪，可配自动自动进样器。

 

2.检测前准备

（1）首次使用时将Firefly Luciferase Reaction Buffer一次性全部倒入Firefly Luciferase Substrate瓶中，充分混匀后按使用需求进行分装并保存于-70℃；

（2）每次使用前以1:4比例将5× Lysis Buffer与ddH2O充分混合，置于冰上备用。配制体积根据实验需求，建议现配现用。

3.操作方法
(1)单管检测方法

1）裂解细胞
a.贴壁细胞：吸去细胞培养基，用PBS缓慢轻容地洗涤一次，洗去残留的培养基，然后将液体全部吸弃。悬浮细胞：离心去上清后，清洗细胞一次再次离心收集细胞沉淀。。
b.按照下表建议加入适量的1×Cell Lysis Buffer，室温下静置或振动摇晃裂解15min，吹打并吸取全部细胞裂解产物至1.5ml离心管中，16000g常温离心5min，取上清用于后续检测。

Cell Culture Plate	6-well	12-well	24-well	48-well	96-well
1×Cell Lysis Buffer	500uL	200uL	100uL	50uL	20uL

注：若萤光素酶的表达水平过低，可适当减少细胞裂解液的使用量以提高蛋白浓度，但需保证裂解液体积可以覆盖细胞孔板底面否则会影响裂解效果。

2）Firefly Luciferase反应检测
小心吸取20uL细胞裂解上清依次加入至检测管或酶标板中，再加入100uL平衡至室温的含有底物的Firefly Luciferase Reaction Buffer，迅速混匀后立即于化学发光仪或酶标仪中检测Firefly Luciferase报告基因活性。（注：务必将反应缓冲液恢复至室温，使酶促反应在最适温度25℃进行。加样后，需要进行混匀，使酶促反应充分稳定进行。本品Firefly 萤光稳定性可达30s以上。）

(2)通过自动进样器进行高通量检测方法

1）裂解细胞
a、贴壁细胞：用排枪吸去细胞培养基，PBS缓慢轻柔地洗涤一次，洗去残留的培养基，然后将液体全部吸弃。悬浮细胞：参考单管检测细胞收集方法，不适合原位裂解。
b、以96孔板为例，用排枪每孔加入20uL 1×Cell Lysis Buffer，室温下静置或振动摇晃裂解15min。

2）Firefly Luciferase反应检测
按照仪器说明书完成自动进样器的初始化操作，设定自动进样器1为溶解底物后的Firefly Luciferase Reaction Buffer。设置检测程序，通过自动进样器1加入100uL平衡至室温的含有底物的Firefly Luciferase Reaction Buffer，振板1-2s混匀，检测Firefly Luciferase报告基因活性。（注：务必将反应缓冲液恢复至室温，使酶促反应在最适温度25℃进行。加样后，需要进行振板混匀，使酶促反应充分稳定进行。本品Firefly 萤光稳定性可达30s以上。）

 

 

注意事项：

1、检测仪器选择：能够检测化学发光的仪器都适用本试剂盒的检测，但是针对相同的样品，不同检测器本底信号值和测量值均可能不同，且对于同一样本检测，不同仪器的数值不可横向比较。为防止孔间干扰，推荐使用黑色酶标板。本产品支持配有自动进样器的酶标仪，可以更好的减小人为操作时间造成的孔间差异，具体操作请参考配套的自动进样器说明书。
2、如果体系中萤光素酶表达量较低，可适当减少裂解用量以提高蛋白浓度，同时应增加检测复孔的数量，以减少低浓度表达造成的孔间差异，确保结果的可靠性。
3、酶促反应对温度较为敏感，加样检测前务必将细胞裂解产物和检测底物均平衡至室温后使用。
4、为保证萤光素酶检测试剂稳定性，可采取适当分装后-70℃冰箱避光保存的方法，以避免反复冻融和长时间暴露于室温。检测前根据需要取适量分装后的反应溶液室温（25℃）水浴复融，充分涡旋混匀后使用。
5、裂解产物与Firefly发光反应液接触后约30s内萤光强度较为稳定，为取得最佳检测结果，在使用单管的化学发光仪检测时，不同样品和底物混合后至上机检测的时间间隔应尽量一致；使用具有化学发光测定功能的多功能酶标仪时，应先把细胞裂解液在孔内加好，然后采用排枪统一加入检测底物并尽快上机检测。
6、使用配有自动进样器的多功能酶标仪进行高通量检测时，注意选择合适的进样速度。加入Firefly Luciferase Reaction Buffer应选择低速模式，避免形成大量气泡。

 

保存条件：

全新试剂盒-20℃保存，一年有效；

 

溶解分装后的Firefly Luciferase Substrate于-70℃避光保存一年，或-20℃短期保存不超过一个月。

 

运输条件：

-10℃干冰运输。

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