Dojindo,SulfoBiotics – 生物素-HPDP(WS) 溶液/500/SB17

Figure 1 Schematic Protocol for Biotin Labeling with Biotin-HPDP(WS) and Purifiation of the Biotinylated Protein

GAPDH 的生物素标记和抗生物素蛋白珠的回收 -< 程序 >1。将溶解缓冲液（35 μl）和溶解缓冲液（5μl）中的 100 mmol/l DTT 加入到 1.5 ml 微管中的 10 μl 1 mg/ml GAPDH 的 PBS 溶液中，并涡旋混合。 2． 37℃孵育30分钟后，将溶液全部转移至10K过滤管中，12000转离心10分钟。 3．向过滤管中加入PBS（50 μl），12,000 rpm离心10分钟。 4．重复第 3 步。 5．将RIPA缓冲液(126 μl)和4 mmol/l Biotin-HPDP(WS)的H2O溶液(14 μl)加入过滤管中，通过移液管与蛋白质混合。 6．滤管37℃保温1小时，12000转/分离心10分钟。 7．向试管中加入 PBS（50 μl），并以 12,000 rpm 的转速离心 10 分钟。 8．重复步骤7。 9．向管中加入中和缓冲液(400 μl)，通过移液管溶解生物素标记的蛋白质，并将溶液转移至1.5 ml-microtube。 10．将步骤 9 的溶液 (50 μl) 添加到试管中的 NeutravidinTM 琼脂糖珠中。 ※ Neutravidin琼脂糖珠在反应前用中和缓冲液洗涤。 11．将溶液在4℃温育1小时。12．将试管以 2,500 rpm 的速度离心 1 分钟，然后使用移液管去除上清液。13。向试管中加入中和缓冲液（+600 mmol/l NaCl）（1 ml）并以 2,500 rpm 的速度离心 1 分钟，然后使用移液器除去上清液。 14．步骤 13 重复两次。 15．将中和缓冲液 (1 ml) 添加到试管中并以 2,500 rpm 离心 1 分钟，然后使用移液器除去上清液。16。重复第 15 步。 17．向试管中加入洗脱缓冲液 (50 μl)，涡旋混合。将溶液在4℃温育1小时。18．将试管以 2,500 rpm 离心 1 分钟，将 10 μl 上清液转移到 1.5 ml 微管中。19。将加载缓冲液 (2 μl) 添加到微管中，并将溶液应用于 SDS-PAGE（CBB 染色）和蛋白质印迹。

Figure 2 Detection of recovered GAPDHComparison between Biotin-HPDP and Biotin-HPDP (WS)

1. S. R. Jaffrey and Solomon H. Snyder, “The Biotin Switch Method for the Detection of S-Nitrosylated Proteins “, Sci. STKE, 2001, 86, pl1.2. X. Wang, N. Kettenhofen, S. Shiva, N. Hogg, and M. Gladwin, “Copper dependence of the biotin switch assay : modified assay for measuring cellular and blood nitrosated proteins”, Free Radic. Biol. Med., 2008, 44, 1362.3. M. T. Forrester, M. W. Foster, M. Benhar, and J. S. Stamler, “Detection of Protein S-Nitrosylation with the Biotin Switch Technique”, Free Radic. Biol. Med., 2009, 46(2), 119.4. M. D. Kornberg, N. Sen, M. R. Hara, K. R. Juluri, J. V. K. Nguyen, A. M. Snowman, L. Law, L. D. Hester, and S. H. Snyder, “GAPDH Mediates Nitrosylation of Nuclear Proteins”, Nat. Cell Biol., 2010, 12(11), 1094.5. J. Wan, A. F. Roth, A. O. Bailey, and N. G. Davis, “Palmitoylated proteins: purifi cation and identification”, Nat. Protoc., 2007, 1573. 6) A. K. Mustafa, M. M. Gadalla, N. Sen, S. Kim, W. Mu, S. K. Gazi, R.K. Barrow, G. Yang, R. Wang, and S. H. Snyder, “H2S Signals Through Protein S-Sulfhydration”, Sci. Signal., 2009, 2(96), ra72.