吖啶酯（NSP-SA-NHS）
分子式：C32H31N3O10S2 分子量：681.73
产品简介：
吖啶酯（NSP-SA-NHS）及其相关化合物已被证明是非常有优势的化学发光标记物，其稳定性、活性和敏感性超过了某些放射性同位素。吖啶酯能与含有一级氨基的蛋白发生反应。在碱性条件下，NHS 作为离去基团被取代，蛋白质与吖啶酯形成稳定的酰胺键。反应完成后，多余的吖啶盐通过脱盐柱除去。
在存在碱性过氧化氢时，吖啶标记的蛋白不需要酶催化可自行发光。具体发光原理是在碱性过氧化氢溶液中，吖啶酯受到过氧化氢离子的进攻，生成一个有张力的不稳定的二氧乙烷，进一步分解成CO2和电子激发态的吖啶酮，当吖啶酮回到基态时发出最大吸收波长430nm的光子。这个发光过程是十分短暂（整个过程的发生小于2秒），触发方案必须增加内部光度计和光子探测器；另外，本产品也可以使用配备自动进样器的多功能酶标仪进行发光数据采集。蛋白质，多肽，抗体，核酸都可以用本产品进行标记。吖啶酯在碱性过氧化氢的激发下快速发光，因此通过收集光子可以检测到标记化合物。
本产品主要用于：化学发光及免疫分析、受体分析、核酸及多肽检测等研究。
物理性状及指标：
外观：……………………黄色粉末
含量：……………………≥97%
储存条件：-20℃，充氮气，避光防潮密闭干燥
储液配置：按表中溶解性配置；如溶解困难，可以通过快速搅拌，超声或温和加热（在45-60°C下水浴）。-80°C 储存时，请在 6 个月内使用，-20°C 储存时，请在 1 个月内使用。
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1 mg | 5 mg | 10 mg |
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1 mM |
1.4669 mL |
7.3343 mL |
14.6686 mL |
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5 mM |
0.2934 mL |
1.4669 mL |
2.9337 mL |
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10 mM |
— |
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— |
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吖啶酯类产品比较 |
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产品货号 |
产品名称 |
CAS号 |
外观 |
结构区别 |
标记方式 |
抗水解性能与稳定性 |
特点 |
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MT0013 |
吖啶酯(NSP-SA-NHS) |
199293-83-9 |
黄色粉末 |
吖啶磺酰胺内盐 |
吖啶酰肼，含有游离氨基，吖啶酰肼末端适用直接偶联含有醛基的多糖,核酸或者蛋白质等。 |
引入了磺酰胺基团，其稳定性较吖啶酯类高，抵抗水解的能力也强于吖啶酯类。在酸性溶液中(pH<4.8)都很稳定 |
最受欢迎的化学发光标记物，稳定性，活性和敏感性都超过了放射性同位素 |
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MT0014 |
吖啶酯(ME-DMAE-NHS) |
115853-74-2 |
绿色粉末 |
吖啶酯类 |
抗体的实质是蛋白，含有胺基，可直接与NHS 活性酯发生反应，进行偶联 |
抗水解性能与稳定性一般 |
可用于蛋白、抗原、抗体、核酸（DNA、RNA）等的标记 |
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MT0015 |
吖啶酯(NSP-DMAE-NHS) |
194357-64-7 |
深绿色粉末 |
吖啶磺酰胺内盐 |
抗体的实质是蛋白，含有胺基，可直接与NHS 活性酯发生反应，进行偶联 |
引入了磺酰胺基团，其稳定性较吖啶酯类高，抵抗水解的能力也强于吖啶酯类。在酸性溶液中(pH<4.8)都很稳定 |
化学发光及免疫分析、受体分析、核酸及多肽检测等研究 |
图1. (A)竞品对照的最大溶解度在DMSO为4mM，而吖啶酯实测溶解度可以到15mM (10mg/ml)。图A中两管吖啶酯均为4mM DMSO 溶液，与竞品对照外观上没有明显差别。(B)多功能酶标仪搭配自动进样器（BioTek）检测发光，设定接收信号滤波片460（±40）nm。2.5mg/ml DMSO溶液继续使用DMSO稀释500倍后（信号较强，防止烧坏仪器）至终浓度5ug/ml，取20ul 加到黑色96孔板并设置3个复孔，自动进样器依次进发光液100uL，同时记录信号值。结果显示相同浓度的吖啶酯DMSO溶液，组的发光略强于对照公司。（吖啶酯发光液配制：0.01M NaOH+ 0.05% 过氧化氢）
图2. 使用较高浓度（10mg/ml）吖啶酯DMSO溶液20uL，直接加入100uL吖啶酯发光液，可以发射出肉眼可见的蓝光（430nm）。但是该信号衰减很快，整个发光时间仅有几秒钟，因此需要使用具有闪光型化学发光采集功能的仪器进行信号采集。
图3. 蛋白标记效果测试。以吖啶酯标记BSA为例，配制2.5mg/ml 吖啶酯 DMSO母液，溶有15mg/ml BSA 的0.2M碳酸氢钠溶液(pH9.0)。为了充分标记BSA，避免染料残留对效果验证的影响，本次实验使用的染料摩尔数低于常规用量，按照染料母液：蛋白溶液=1：100 体积比，总体积1ML。室温标记1h后，过G25脱盐柱，纯化缓冲液为磷酸一氢钠/磷酸二氢钠 （1:1） 0.1M 混合体系，PH=6.7(盐酸微调)。结果显示，相同的标记浓度体系，同一个G25纯化柱纯化，吖啶-BSA 发光体系也设定相同，吖啶-BSA流出液的颜色比竞品对照更深一些（图A）。虽然标记前，两家的吖啶酯光强相似，但是标记后，的光强更有优势，比对照高一个数量级（图B），说明蛋白标记对组的吖啶发光基团的影响最小，并且的吖啶酯在碱性标记蛋白质过程中也更加稳定，优于竞品对照！
使用说明（举例抗体/蛋白质标记）：
1.配制
标记缓冲液：0.2M NaHCO3 (pH=9.0)；
标记终止缓冲液： 10% 赖氨酸 0.2M NaHCO3 (pH=9.0)溶液；
脱盐纯化缓冲液：0.1M Na2HPO4-NaH2PO4 (pH=6.5)；
吖啶酯发光液：(0.01~0.1M) NaOH+0.05% H2O2 。
2. 计算标记所用抗体（蛋白质）和吖啶酯的量：
通常设定摩尔比n(抗体): n(吖啶酯)=1:10~1:50，具体需根据氨基酸组分进行摸索调整；
配制2.5mg/ml 吖啶酯-DMSO母液，注意玻璃器皿盛放并避光；
使用0.2M NaHCO3（pH=9.0） 溶液配制0.1~0.5 mg/ml 抗体反应液 。
3. 连接及纯化
本说明书举例针对标记抗体抗体的分子量为 180kd 对应 15 倍的吖啶酯。如果用户的待标记样品是其他的分子量，请参考附表 1 改变试剂的配比。
1．取 10 µL 稀释吖啶酯母液 (2.5mg/ml)，加入 90 µL 无水 DMSO(or DMF) 稀释10倍，配成吖啶酯工作液 (0.25mg/ml)。
2．使用0.2M NaHCO3 (pH=9.0)溶液稀释 50µg 的抗体至 300 µL，加入 10 µL吖啶酯工作液 (0.25mg/ml)（参考附表 1）。
3．锡箔纸包好，室温标记0.5~1h。
4．淬灭反应，加入 100 µL 标记终止缓冲液，室温混匀 30 分钟（注：如果标记较充分，也可以跳过此步骤，直接进行柱纯化）。
5. 脱盐柱纯化，收集吖啶标记蛋白组分并检测浓度，请参考说明书后文。
6．检测标记的蛋白，取10µL吖啶标记蛋白，放于黑色96孔板中，向每个微孔注入 50 µL~150µL吖啶酯发光液，立即检测，如果发光过强，可以对标记蛋白再进行若干倍的稀释，使其在仪器的发光检测限内。注：吖啶酯发光液最好现用现配，或者将NaOH溶液和过氧化氢溶液分别配成2x母液，使用的时候再1：1进行混合。
7．吖啶酯标记的蛋白可以在酸性缓冲液中4℃避光存储（注意补加叠氮钠等防腐剂），如果储存效果不佳，则请避光保存于-20℃或者-80℃。
注意事项：
1.吖啶酯除了DMF，也可以用无水DMSO等非质子性溶剂来溶解。通常吖啶酯用DMF最高溶解的浓度为4mM (约2.7mg/ml)，我司生产的吖啶酯中DMSO中溶解度可达10mg/ml。
2.标记前，由于吖啶酯末端羧基经NHS活化,较为活泼，请用非质子性的干燥无水溶剂来溶解；标记后，标记后吖啶酯与被标记物之间以酰胺键或者酯键等形式存在，酸性溶剂基本没有影响；吖啶酯本身活性位点在碱性和氧化环境下不稳定，因此应根据被标记物的稳定性配制相应的非强碱性非氧化的体系中处理和保存。
3.发光标记物在光照条件下有可能部分分解，以致影响发光效果。吖啶酯的实验操作和储存建议避光条件下处理，目前暂时没有具体的研究数据。
4.吖啶酯标记蛋白等大分子化合物建议用G25脱盐柱分离；吖啶酯标记小分子化合物建议用柱层析分离;
5.吖啶酯发光过程是十分短暂（整个过程的发生小于2秒），触发方案必须增加内部光度计和光子探测器；另外，本产品也可以使用配备自动进样器的多功能酶标仪进行发光数据采集，最大限度降低加样时间对采集信号的影响。
6.吖啶酯标记化学发光检测仪器推荐：
美国PE公司的 Wallac 1420 多功能检测仪,
德国西门子拜耳化学发光仪ADVIA Centaur
附表 1： 吖啶用量对照表
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蛋白分子量 |
吖啶酯工作液 |
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10kDa-50kDa |
1-3 μL |
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50kDa-100kDa |
3-7 μL |
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100kDa-150kDa |
7-10 μL |
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150kDa-200kDa |
10-13 μL |
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200kDa-250kDa |
13-17 μL |
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250kDa-300kDa |
17-20 μL |
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300kDa-350kDa |
20-23 μL |
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350kDa-400kDa |
23-27 μL |
吖啶酯标记蛋白效率计算方法
1. 取100uL 待测样品，稀释至Abs280在0.1~1.5之间；
2. 向1中加入少量盐酸，调整至pH=1~2，使其形成具有黄色特征的盐溶液，吸收峰在367nm
3. 分别测试待测样品的Abs280nm 和Abs367nm ；
4. Equation1: 吖啶酯浓度(mol/L)=Abs367/14650 ；
5. 校正蛋白Abs280数值
Equation2: Abs280(校正后) = Abs280- (Abs367×0.17);
6. 准备1mg/ml 未标记的蛋白溶液（e.g. 50ug 蛋白加入50µL 标记缓冲液），取出10µL 并补加490µL ddH2O (稀释50倍)。读取Abs280nm ，并乘以稀释倍数。
7. 计算蛋白质量浓度（mg/ml）
Equation3:蛋白摩尔浓度 （mol/L）
8. 计算F/P摩尔比
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